Laser-vållad skada av Zebrafish embryonala skelettmuskulatur

Summary

Den metod som presenteras här omfattar exakta skada levande zebrafisk embryon med hög energi laserpulser och efterföljande analys av dessa skador och deras återhämtning med tiden. Vi visar också hur genetiskt märkta enstaka eller grupper av skelettmuskelceller kan spåras under och efter laserljus inducerad skada.

Abstract

Olika experimentella metoder har använts i musen för att framkalla muskelskada i syfte att studera muskler förnyelse, inklusive myotoxin injektioner (bupivakain, cardiotoxin eller notexin), transplantationer muskler (denervering-devascularization inducerad regenerering), intensiv träning, men också murina muskeldystrofi modeller såsom MDX musen (för en genomgång av dessa metoder se ^1). I zebrafisk, genetiska tillvägagångssätt inkluderar mutanter som uppvisar muskeldystrofi fenotyper (t.ex. runzel ² eller sapje ³⁾ och antisens oligonukleotid morpholinos som blockerar uttrycket av dystrofi-associerade gener ^4. Dessutom, kemiska metoder är också möjliga, t ex med Galantamin, en kemisk förening som inhiberar acetylkolinesteras, vilket resulterar i hypercontraction, vilket slutligen leder till muskeldystrofi ^5. Men genetiska och farmakologiska metoder generally påverkar alla muskler i en individ, medan omfattningen av fysiskt förorsakat skador lättare att kontrollera rumsligt och tidsmässigt ^1. Lokaliserad fysiska skador möjligt att bedöma om kontralaterala muskeln som en intern kontroll. Faktiskt använde vi nyligen laser-medierad cell-ablation för att studera skelettmuskulaturen regenerering i zebrafisk embryot ^6, medan en annan grupp nyligen rapporterat användningen av en två-foton laser (822 nm) för att skada mycket lokalt plasmamembranet enskilda embryonala zebrafisk muskel celler ^7.

Här rapporterar vi ett förfarande för användning av micropoint lasern (Andor Technology) för skelettmuskulatur cellskada i zebrafisk embryot. Den micropoint laser är en hög energi laser som är lämplig för målsökt cell ablation vid en våglängd av 435 nm. Lasern är ansluten till ett mikroskop (i vår inställning, ett optiskt mikroskop från Zeiss) på ett sådant sätt att mikroskopet kan användas samtidigt feller fokusera laserljuset mot provet och för att visualisera effekterna av sårskada (ljusfält eller fluorescens). Parametrarna för styrning laserpulser inkluderar våglängd, intensitet och antalet pulser.

På grund av dess öppenhet och extern embryonal utveckling är zebrafisk embryot mycket mottaglig för både laser-inducerad skada och för att studera den efterföljande återhämtningen. Mellan 1 och 2 dagar efter gödsling, somitic skelettmuskelceller genomgår successivt mognad från främre till posterior grund av utvecklingen av somitogenesis från stammen till svansen ^{8, 9.} Vid dessa stadier, embryon rycka spontant och initiera simning. Zebrafisk har nyligen erkänts som en viktig ryggradsdjur modellorganism för att studera vävnadsregenerering, eftersom många typer av vävnader (hjärt-, neuronal, vaskulär etc.) kan regenereras efter skada i den vuxna zebrafisk ^{10, 11.}

Protocol

1. Märkning enskilda celler Injicera en-cellstadiet embryon med en plasmid som kodar GFP eller någon GFP-fusionsprotein under kontroll av en β-aktin-promotorn. Under utvecklingen, är GFP uttrycks sedan i en mosaik sätt. Här har vi använt den transgena konstruktionen Tg [β-aktin: α-aktinin-GFP], vilket placerar α-aktinin-GFP fusionsprotein under kontroll av β-aktinpromotorn. 2. Embryo Inbäddning Samla zebrafisk…

Representative Results

Laser-medierad skada utfördes på immobiliserade 1 dagar gamla embryon. Såsom visas i figur 1, kan ett par laserpulser genererar ett litet sår, lätt identifieras av de skadade, lindade, aktin-rika myofibriller som normalt sträckta mellan somit gränser. Ett större antal laserpulser kommer dock att resultera i en kraftigt skadad somit blocket, där de flesta myofibriller förstörs. Ändå kan vi konstatera bokstavligen att "tiden läker alla sår", med små skador healing snabbare än st…

Discussion

Laser-medierad skada är en kraftfull metod för att tillfoga sår av en önskad storlek genom ablation celler för att studera regenerering under kontrollerade förhållanden i zebrafisk embryot. Noterbart kan celler riktas exakt (figur 2) och både skadan området samt timing kan styras. Därefter skadan webbplats och för att återhämta sig lätt övervakas, registreras (Figur 3) och analyserades (figur 1). Även lasern fokuserade i x-och y-axeln, är det inte helt …

Materials

Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
			Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)