Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama
Summary
Burada sunulan yöntem, yüksek enerjili lazer darbeleri ve zamanla bu yaralanmalar ve kurtarma ileri analizi ile canlı zebrafish embriyo kesin hasar oluşur. Ayrıca genetik olarak tek etiketli veya iskelet kas hücre gruplarının sırasında ve lazer ışık kaynaklı hasar sonrası takip edilebilir göstermek.
Abstract
Çeşitli deneysel yaklaşımlar murin müsküler distrofi modelleri de myotoxin enjeksiyonları (bupivakain, cardiotoxin veya notexin), kas nakilleri (denervasyon-devaskülarizasyonun bağlı rejenerasyon), yoğun egzersiz, kas yenilenme çalışma amacı ile kas yaralanma ikna etmek için fare kullanılır, ama oylandı mdx fare (bu yaklaşımların bir inceleme için 1'e bakınız) gibi. Zebrafish, genetik yaklaşımlar müsküler distrofi fenotipleri (örneğin runzel 2 ya da 3 sapje gibi) sergilerler ve distrofi ile ilişkili genlerin ekspresyonunu engellemek 4 morpholinos antisens oligonükleotid mutantları sayılabilir. Bunun yanı sıra, kimyasal yaklaşımlar ve böylece sonuçta müsküler distrofi 5 yol açar hypercontraction oluşur, bunların, aynı zamanda Galanthamine, bir asetilkolinesteraz inhibe edici kimyasal bileşik, örneğin mümkündür. Ancak, genetik ve farmakolojik yaklaşımlar gfiziksel yaralanmalar ölçüde daha kolay ve mekansal 1 kontrol edilir ise enerally, bireyin içindeki tüm kasları etkileyebilir. Lokalize fiziksel yaralanma bir iç kontrol olarak kontralateral kas değerlendirmesini sağlar. Başka bir grup son zamanlarda çok lokal bireyin embriyonik zebrafish kas plazma zarı zarar iki foton lazer (822 nm) kullanımı rapor Nitekim, biz son zamanlarda, zebrafish embriyo 6 iskelet kas yenilenme incelemek için lazer aracılı hücre ablasyon kullanılır hücreleri 7.
Burada, zebrafish embriyo iskelet kas hücre hasarı için Micropoint lazer (Andor Teknolojisi) kullanımı için bir yöntem sunulmuştur. Micropoint lazer 435 nm dalga boyunda hedeflenen hücre ablasyon için uygun bir yüksek enerjili lazer. Lazer mikroskop aynı zamanda f da kullanılabilir ki bu tür bir şekilde (bizim kurulum, Zeiss bir optik mikroskop) bir mikroskop ile bağlanırveya numune üzerine ve yaralama (aydınlık veya floresans) etkileri görselleştirmek için lazer ışık odaklama. Lazer darbeleri kontrol parametreleri dalga boyu, yoğunluk ve bakliyat numarasını içerir.
Şeffaflığını ve dış embriyonik gelişme nedeniyle, zebrafish embriyo lazer kaynaklı yaralanma ve hem de daha sonraki iyileşme incelemek için çok müsait olan. 1 ila 2 gün sonrası fertilizasyon, somitic iskelet kas hücreleri giderek kuyruk 8, 9 gövdesinden somitogenesis ilerlemesi nedeniyle posterior anterior olgunlaşması uğrarlar. Bu aşamalarda, embriyo kendiliğinden seğirme ve yüzme başlatabilir. Zebrafish yakın yetişkin zebrafish 10, 11 yaralanma sonrası rejenere edilebilir dokuların birçok türleri (vb vasküler, nöronal, kardiyak) gibi, doku rejenerasyon çalışması için önemli bir omurgalı model organizma olarak kabul edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lazer-aracılı yaralanma zebrafish embriyo kontrollü koşullarda rejenerasyon incelemek amacıyla hücreleri ablasyonu ile istenilen büyüklükte yaralar için güçlü bir yöntemdir. Özellikle, tam hücreler hedef olabilir (Şekil 2) ve yara alanı gibi zamanlama her ikisi de kontrol edilebilir. Daha sonra, yaralanma bölgesinde ve yenilenme işlemleri kolayca izlenir, kaydedilmiş (Şekil 3) ve (Şekil 1) analiz edilir. Lazer de x-ve y-ekseninde odaklanmıştır …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz teknik yardım ve danışma için Bob Nowak (Andor Teknolojisi) teşekkür ederim. SA-S. Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bir Heisenberg dostluk tarafından desteklenmektedir. Bu eser hibe SE2016/7-1 DFG tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|
Referências
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).
- Steffen, L. S. The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene. Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).
- Otten, C., et al. Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish. PLoS One. 7, e31041 (2012).
- Roostalu, U., Strähle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth. Development. 134, 1253-1257 (2007).
- Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
