에 대한 바이러스 나노 입자<em> 생체에</em> 종양 이미징
Summary
공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.
Abstract
나노 소재의 사용은 재료 과학 및 의학에 혁명을 할 수있는 가능성이 있습니다. 현재, 서로 다른 나노 입자의 수는 이미징 및 치료에 응용 프로그램에 조사하고 있습니다. 식물에서 파생 바이러스 성 나노 입자 (VNPs)가 정의 크기와 모양으로 자기 조립 bionanomaterials으로 간주 할 수 있습니다. Steinmetz 연구실에서 조사중인 공장 바이러스는 직경 30 nm의 아르 둘 다 Cowpea 모자이크 바이러스 (CPMV)와 Brome 모자이크 바이러스 (BMV)에 의해 형성 icosahedral 입자가 포함되어 있습니다. 우리는 또한 다음과 같은 식물 바이러스로부터 파생 된 막대 모양과 filamentous 구조를 개발하고 있습니다 : 18 나노 미터로 300 nm의 크기, 그리고 filamentous 입자 515를 형성 감자 바이러스 X (PVX)로 강성 봉을 형성 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 길이, 폭 13 나노 미터의 나노 미터는 (독자는 심판이 판결이라고합니다. VNPs에 대한 자세한 내용은 1, 2).
<p class="jove_content">보기의 재료 과학자의 관점에서 VNPs 여러 가지 이유가 매력적인 빌딩 블록입니다 입자가 monodisperse 아르 planta에 대규모로 쉽게 제작 할 수 매우 안정적이고 biocompatible 있습니다. 또한, VNPs는 특히 유전자 변형 또는 화학 bioconjugation 방법 3을 사용 설계 할 수 있습니다 "프로그램"단위입니다. VNPs의 구조는 원자 해상도로 알려져 있으며, 수정은 원자 레벨 4, 현재의 최첨단 기술과 합성 나노 소재를 사용하여 달성 할 수없는 제어 수준의 공간적 정밀도로 수행 할 수 있습니다.이 논문에서, 우리는 CPMV, PVX, TMV, 그리고 Vigna ungiuculata와 Nicotiana benthamiana 공장에서 BMV의 전파에 대해 설명합니다. 각 VNP에 대한 추출 및 정제 프로토콜은 주어집니다. 정화되고 화학적으로 라벨이 표시된 VNPs의 특성에 대한 방법은 설명되어 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 채널에 초점을emical fluorophores과 VNPs의 라벨 (예를 들면, 알렉사 형석 647) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 염료는 추적 및 5-10 VNPs의 확인을 용이하게하고, 자신의 pharmacokinetics 8,11을 향상하는 동안 PEG는 proteinaceous 나노 입자의 immunogenicity을 감소시킨다. 우리는 마우스 이종 이식 종양 모델을 사용 PEGylated VNPs의 유도 종양을 보여줍니다. 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 조직 예 생체의 형광 이미징, 균질 조직의 형광 정량화하고, 공 촛점 현미경의 조합이 biodistribution을 연구하는 데 사용됩니다. VNPs는 reticuloendothelial 시스템 (RES)를 통해 해제되며, 추적 종양이 향상된 투자율 및 유지 (EPR) 효과를 통해 수동적으로 12 달성된다. VNP의 나노 기술은 강력한 플러그 앤 플레이 이미지에 기술하고 생체 내 질병의 사이트를 취급합니다. 우리는 더에 약물 cargos 및 임상 – 관련 영상 moieties뿐만 아니라 조직 별 리간드를 수행 할 VNPs를 개발하고 있습니다암과 심장 혈관 질환에 overexpressed 분자 수용체를 타겟팅합니다.
Protocol
1. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 전파 실내 식물 챔버 하루 15 시간 (100 % 등, 25 ° C, 65 % 습도)와 밤 9 시간 (0 % 등, 22 ° C, 60 % 습도)에 제어합니다. 표 1의 타임 라인에 따라 식물의 예방. CPMV PVX, TMV, 그리고 BMV 일 0 : 공장 3 cowpea 씨앗 / 화분. 일 0 : 공?…
Representative Results
Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation. <img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/4352…
Discussion
이 프로토콜은 생체 종양 이미징에 대한 VNPs 및 응용 프로그램의 화학 조작을위한 접근 방식을 제공합니다. 여기에 제시된 동물 형광 이미징, 형광 정량화 및 immunohistochemistry 기술 biodistribution을 공부하고 종양 추적 평가하는 데 유용합니다. 이 기술은 EPR 효과를 통해 종양에 나노 입자의 접근에 관한 귀중한 정보를 제공합니다. 다양한 분석 방법의 결과를 결합하여, 우리는 VNPs의 지?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH / NIBIB 보조금 R00 EB009105 (NFS로)와 P30 EB011317 (NFS에), NIH / NIBIB 훈련 보조금 T32 EB007509 (AMW에), 케이스 웨스턴 리저브 대학의 학제 연합 투자 기금 (NFS로)에 의해 지원되었다 및 사례 종합 암 센터 보조금 P30 CA043703 (NFS로). 우리는의 Steinmetz 연구실 학부 학생 연구원에게 감사 실질적인 지원 : 나디아 Ayat, 케빈 첸, Sourav (SID) 데이, 앨리스 양 샘 알렉산더, 크레이그 D' 크루즈 스티븐 왜가리, 로렌 랜돌프, 브라이언 그래서 바울 Chariou .
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack’s Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 |
Referências
- Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
- Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
- Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
- Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
- Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
- Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
- Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
- Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
- Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with “click” chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
- Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
- Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
- Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
Tags
NanoparticlesIn Vivo Tumor ImagingNanomaterialsMaterials ScienceMedicinaViral Nanoparticles (VNPs)Plant VirusesCowpea Mosaic Virus (CPMV)Brome Mosaic Virus (BMV)Tobacco Mosaic Virus (TMV)Potato Virus X (PVX)Monodisperse ParticlesLarge-scale ProductionStabilityBiocompatibilityGenetic ModificationChemical Bioconjugation MethodsAtomic Resolution
Citar este artigo
Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).