Une nouvelle méthode pour la Culture et polarisé stimulation des explants de muqueuse intestinale de l'homme
Summary
Nous introduisons une nouvelle méthode pour le maintien de la muqueuse intestinale humaine dans la culture et le suivi de la réponse à différents types de stimuli sur au moins 24 heures. Avec notre procédé, la polarité de la conservation du tissu, ce qui permet une stimulation physiologique par voie apicale.
Abstract
Peu de modèles existent actuellement pour simuler de façon réaliste micro-environnement de la complexité humaine intestin, où une variété d'interactions ont lieu. Homéostasie correcte dépend directement de ces interactions, comme elles façonnent une réponse immunologique toute tolérance inducteur contre des antigènes alimentaires tandis que dans le même temps de montage des réponses immunitaires efficaces contre les microbes pathogènes accidentellement ingéré avec les aliments.
Homéostasie intestinale est préservée aussi à travers diverses interactions complexes entre le microbiote (y compris les souches bactériennes bénéfiques liés à des aliments) et l'hôte, qui régulent l'attachement / dégradation de mucus, la production de peptides antimicrobiens par la barrière épithéliale, et «l'éducation» des cellules épithéliales »qui contrôlent le phénotype tolérogénique ou immunogène de cellules lymphoïdes uniques, gut-résidents» des populations. Ces interactions ont été jusqu'à présent très difficile à reproduire avec des essais in vitroen utilisant soit des lignées de cellules en culture ou des cellules mononucléaires du sang périphérique. En outre, des modèles de souris diffèrent sensiblement dans les composants de la muqueuse intestinale (organisation de la couche de mucus, de la communauté des bactéries commensales) par rapport à l'intestin humain. Ainsi, des études sur une variété de traitements soient traduits dans les cliniques pour les conditions importantes liées au stress ou pathologiques tels que le syndrome du côlon irritable, les maladies inflammatoires de l'intestin ou de cancer colorectal ont été difficiles à réaliser.
Pour répondre à ces questions, nous avons développé un nouveau système qui nous permet de stimuler des explants de muqueuse intestinale de l'homme qui conservent leur in situ conditionné par le microbiote hôte et la réponse immunitaire, d'une manière polarisée. Stimulation apicale polarisée est d'une grande importance pour l'issue de la réponse immunitaire provoquée. Il a été démontré à plusieurs reprises que les mêmes stimuli peuvent produire des réponses complètement différentes quand ils contournent la face apicale de l'épidémie intestinalethelium, en stimulant les cellules épithéliales basolatéral ou d'entrer en contact direct avec les composants de la lamina propria, le passage du phénotype de tolérogénique à immunogène et provoquant une inflammation excessive et inutile dans la région.
Nous avons atteint stimulation polarisée par collage d'une bouteille de cave qui délimitait la zone de stimulation sur la face apicale de la muqueuse comme cela sera décrit dans le protocole. Nous avons utilisé ce modèle pour examiner, entre autres, les effets différentiels des trois souches de lactobacilles différentes. Nous montrons que ce système modèle est très puissant pour évaluer les propriétés immunomodulatrices des probiotiques dans des conditions saines et la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nécessité pour les modèles physiologiquement pertinents sur lesquels les traitements pour la muqueuse intestinale humaine peuvent être valablement testées a longtemps été soulignée. De nombreux chercheurs ont identifié les artefacts et les défauts potentiels dans les deux cellules 5 et 6 modèles murins utilisés jusqu'ici à cette fin. En effet, même si les données précliniques prometteurs sont souvent obtenus, ceux-ci se traduisent rarement à l'avantage clinique significa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Erika Mileti pour un excellent support technique et le Dr Antonio Di Sabatino pour fournir des chambres à oxygène.
Financement: Ce travail a été soutenu par des subventions du programme-cadre de l'UE 7 (IBDase, ERC: Dendroworld) et la Fondazione Cariplo à MR et le soutien d'un réseau international Marie Curie de formation à la mobilité (Cross-Talk, accord de subvention n °: 21553-2) à KT.
Materials
| Regeant | Company | Catalog No. | |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6×8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8×8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10×10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità |
Referências
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