Eine neue Methode für die Kultur und polarisierte Stimulation der menschlichen Darmschleimhaut Explantate
Summary
Wir stellen ein neues Verfahren für die Pflege der menschlichen Darmschleimhaut in Kultur und Überwachung der Reaktion auf verschiedene Arten von Stimuli über mindestens 24 Stunden. Mit unserer Methode wird die Polarität des Gewebes aufrechterhalten wird, so dass für eine physiologische Stimulation über die apikale Route.
Abstract
Wenige Modelle existieren derzeit realistisch zu simulieren, die komplexe menschliche Darm Mikro-Umgebung, in der eine Vielzahl von Interaktionen stattfinden. Proper Homöostase hängt direkt von dieser Wechselwirkungen, wie sie eine ganze Immunantwort induzieren Toleranz gegen Nahrungsmittel-Antigene zu gestalten, während gleichzeitig Montage effektive Immunantwort gegen pathogene Mikroben versehentlich mit der Nahrung aufgenommen.
Intestinale Homöostase wird auch durch verschiedene komplexe Wechselwirkungen zwischen dem microbiota (einschließlich Lebensmittel-assoziierte positive Bakterienstämme) und der Gastgeber, die die Anlage / Abbau von Schleim regulieren erhalten, die Produktion von antimikrobiellen Peptiden durch die epithelialen Barriere, und die "Erziehung" der Epithelzellen Bevölkerungen, die die tolerogenen oder immunogen Phänotyp der einzigartigen, gut-resident Lymphoidzellen steuert ". Diese Wechselwirkungen sind bisher sehr schwierig, mit in-vitro-Assays zu reproduzieren gewesenentweder mit kultivierten Zelllinien oder peripheren mononukleären Blutzellen. Darüber hinaus unterscheiden sich im Wesentlichen in Mausmodellen Komponenten der Darmschleimhaut (Schleimschicht Organisation, symbiotischer Bakterien Gemeinde) in Bezug auf den menschlichen Darm. So haben Studien von einer Vielzahl von Anwendungen in der Klinik für wichtige stressbedingten oder pathologischer Zustände, wie Reizdarmsyndrom, entzündliche Darmerkrankung oder Darmkrebs gebracht schwierig durchzuführen.
Um diese Probleme anzugehen, haben wir ein neues System, das uns zu den Explantaten der menschlichen Darmschleimhaut, die ihre in situ Konditionierung behalten durch den Host Mikroflora und Immunantwort zu stimulieren, in einer polarisierten Mode ermöglicht. Polarized apikalen Stimulation ist von großer Bedeutung für das Ergebnis der ausgelösten Immunantwort. Es hat sich wiederholt gezeigt, dass die gleichen Reize können ganz unterschiedliche Reaktionen hervorrufen, wenn sie das Gesicht der apikalen Darm epi umgehenEndothel, anregend Epithelzellen basolateral oder in direkten Kontakt mit Lamina propria Komponenten, Schalt den Phänotyp von tolerogenen um immunogen und unnötige und exzessive Entzündung in der Umgebung.
Wir erzielten polarisierten Stimulation durch Kleben eine Höhle Zylinder begrenzt die Fläche der Stimulation auf der apikalen Seite der Schleimhaut im Protokoll beschrieben. Wir haben dieses Modell zu prüfen, unter anderem, unterschiedliche Auswirkungen von drei verschiedenen Laktobazillen-Stämme. Wir zeigen, dass dieses Modell sehr leistungsfähiges System, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von Probiotika bei gesunden und Krankheitszuständen beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Bedarf an physiologisch relevanten Modelle, auf denen Behandlungen für den menschlichen Darmschleimhaut wirksam getestet werden seit langem betont. Viele Forscher haben potentielle Artefakte und Defekte in den beiden Zellen 5 und 6 Mausmodellen bisher für diesen Zweck verwendet identifiziert. In der Tat, obwohl vielversprechende präklinische Daten oft erhalten wird, diese nur selten zu signifikanten klinischen Nutzen übersetzen.
Das Verfahren in dieser Arbeit be…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Erika Mileti für hervorragende technische Unterstützung und Dr. Antonio Di Sabatino für die Bereitstellung der Sauerstoff Kammern.
Finanzierung: und Fondazione Cariplo zu MR und Unterstützung durch einen internationalen Marie-Curie Training Mobilität Netzwerk (Cross-Talk, Finanzhilfevereinbarung Nr.: 21553-2) an: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem 7. EU-Rahmenprogramm (Dendroworld IBDase, ERC) unterstützt KT.
Materials
| Regeant | Company | Catalog No. | |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6×8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8×8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10×10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità |
Referências
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?. Gut Microbes. , (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology–a review. Int. J. Food Microbiol. 141, S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
