En ny metode for kultur og polarisert Stimulering av menneskelige tarmslimhinnen explants
Summary
Vi introduserer en ny fremgangsmåte for vedlikehold av human intestinal mukosa i kultur og overvåking av responsen på ulike typer stimuli over minst 24 timer. Med foreliggende fremgangsmåte, er polariteten av vev opprettholdes, slik at for en fysiologisk stimulering via den apikale rute.
Abstract
Få modeller i dag eksisterer for å realistisk simulere komplekse menneskelige tarmen mikro-miljø, der en rekke interaksjoner finner sted. Riktig homeostase er direkte avhengig av disse interaksjonene, så de former en hel immunologisk respons indusere toleranse mot mat-antigener, mens på samme tid montering effektive immunresponser mot patogene mikrober puttes i munnen sammen med mat.
Intestinal homeostase er bevart også gjennom forskjellige komplekse interaksjoner mellom den bakterieflora (inkludert mat-forbundet fordelaktige bakteriestammer) og verten, som regulerer fundament / degradering av slim, produksjon av antimikrobielle peptider ved den epiteliale barrieren, og "utdannelse" i epitelceller 'som styrer tolerogenic eller immunogenic fenotype av unike, gut-resident lymfoide celler' populasjoner. Disse interaksjonene har vært så langt veldig vanskelig å gjengi med in vitro analyserved hjelp av enten dyrkede cellelinjer eller perifere mononukleære blodceller. I tillegg musemodeller avviker vesentlig i komponenter av tarmslimhinnen (slim lag organisasjon, kommensal bakterie fellesskap) med hensyn til den menneskelige tarm. Således har undersøkelser av en rekke behandlinger for å bli brakt i klinikker for viktige stressrelaterte eller patologiske tilstander slik som irritabel tarmsyndrom, inflammatorisk tarmsykdom eller kolorektal kreft har vært vanskelig å utføre.
For å løse disse problemene, har vi utviklet et nytt system som gjør oss i stand til å stimulere explants av menneskelig tarmslimhinnen som beholder sin in situ condition av verten bakterieflora og immunrespons, i en polarisert mote. Polarisert apical stimulering er av stor betydning for utfallet av fremkalte immunrespons. Det har gjentatte ganger blitt vist at de samme stimuli kan produsere helt forskjellige responser når de omgå den apikale ansiktet til den intestinale epithelium, stimulere epitelceller basolaterally eller kommer i direkte kontakt med lamina propria komponenter, bytte fenotypen fra tolerogenic til immunogenic og forårsaker unødvendig og overdreven betennelse i området.
Vi oppnådde polarisert stimulering ved å lime en hule sylinder som avgrenses området stimulering på den apikale forsiden av slimhinnen som vil bli beskrevet i protokollen. Vi brukte denne modellen til å undersøke, blant andre, differensial effekten av tre forskjellige Lactobacilli stammer. Vi viser at denne modellen systemet er svært kraftig for å vurdere immunmodulerende egenskaper av probiotika i friske og sykdom forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behovet for fysiologisk relevante modeller på hvilke behandlinger for human intestinal mukosa kan være gyldig testet har lenge blitt understreket. Mange forskere har identifisert mulige gjenstander og mangler i både celle 5 og mus modeller seks brukt så langt for det formålet. Faktisk, selv om lovende prekliniske data blir ofte innhentet, disse sjelden oversette til betydelig klinisk nytte.
Metoden som beskrives i dette arbeidet, oppviser en forholdsvis enkel, men …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Erika Mileti for god teknisk støtte og Dr. Antonio Di Sabatino for å gi oksygen kamre.
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra EUs 7. rammeprogram (IBDase, ERC: Dendroworld) og Fondazione Cariplo til MR og støtte av en Marie Curie internasjonale opplæring mobilitet nettverk (Cross-Talk, stipendavtale No: 21553-2) til KT.
Materials
| Regeant | Company | Catalog No. | |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6×8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8×8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10×10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità |
Referências
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?. Gut Microbes. , (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology–a review. Int. J. Food Microbiol. 141, S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
