Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana
Summary
Se introduce un nuevo método para el mantenimiento de la mucosa intestinal humana en la cultura y el seguimiento de la respuesta a diversos tipos de estímulos durante al menos 24 horas. Con nuestro método, se mantiene la polaridad del tejido, lo que permite una estimulación fisiológica a través de la ruta apical.
Abstract
Pocos modelos existen actualmente para simular de forma realista micro-entorno del complejo del intestino humano, donde una variedad de interacciones tienen lugar. La homeostasis adecuada depende directamente en estas interacciones, que dan forma a una respuesta inmunológica toda la inducción de tolerancia contra antígenos de los alimentos, mientras que al mismo tiempo de montaje de las respuestas inmunes eficaces contra los microbios patógenos ingeridos accidentalmente con alimentos.
La homeostasis intestinal se conserva también a través de diversas interacciones complejas entre la microbiota (incluyendo cepas bacterianas beneficiosas relacionados con los alimentos) y el anfitrión, que regulan la fijación / degradación de la mucosidad, la producción de péptidos antimicrobianos por la barrera epitelial, y la "enseñanza" de células epiteliales de que controla el fenotipo tolerogenic o inmunogénica de las células linfoides únicos, gut-residentes "poblaciones. Estas interacciones han sido hasta ahora muy difícil de reproducir en los ensayos in vitroya sea utilizando líneas de células cultivadas o células mononucleares de sangre periférica. Además, los modelos de ratón difieren sustancialmente en los componentes de la mucosa intestinal (organización capa de moco, las bacterias comensales comunidad) con respecto a el intestino humano. Por lo tanto, los estudios de una variedad de tratamientos de cesación en las clínicas para las condiciones importantes relacionados con el estrés o patológicos tales como el síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer colorrectal han sido difíciles de llevar a cabo.
Para abordar estas cuestiones, hemos desarrollado un novedoso sistema que nos permite estimular explantes de mucosa intestinal humana que mantienen su in situ acondicionado por la microbiota de acogida y la respuesta inmune, de manera polarizada. Estimulación apical polarizado es de gran importancia para el resultado de la respuesta inmunitaria provocada. Se ha demostrado repetidamente que los mismos estímulos pueden producir completamente diferentes respuestas cuando se pasan por alto la cara apical de la epi intestinalthelium, estimulación de las células epiteliales hacia la membrana basolateral o que entren en contacto directo con los componentes de la lámina propia, cambiando el fenotipo de tolerógeno a inmunogénica y causando la inflamación innecesaria y excesiva en la zona.
Hemos logrado la estimulación polarizada por un cilindro de encolado cueva que delimita la zona de estimulación en la cara apical de la mucosa como se describe en el protocolo. Se utilizó este modelo para examinar, entre otros, los efectos diferenciales de las tres cepas de lactobacilos diferentes. Se demuestra que este modelo de sistema es muy poderoso para evaluar las propiedades inmunomoduladoras de los probióticos en buenas condiciones de salud y la enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mucho tiempo se ha hecho hincapié en la necesidad de modelos fisiológicamente relevantes en los que los tratamientos para la mucosa intestinal humana se pueden probar válida. Muchos investigadores han identificado artefactos y defectos tanto en la célula 5 y 6 modelos de ratón utilizado hasta ahora para tal fin. En efecto, a pesar de que los datos preclínicos prometedores se obtienen a menudo, éstos rara vez se traducen en un beneficio clínico significativo.
El …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Erika Mileti para un excelente soporte técnico y el Dr. Antonio Di Sabatino para proporcionar las cámaras de oxígeno.
Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas de los programas marco de la UE séptimo (IBDase, ERC: Dendroworld) y Fondazione Cariplo a MR y el apoyo de una red Marie Curie de Formación Internacional Movilidad (Cross-Talk, del acuerdo de subvención n º: 21553-2) para KT.
Materials
| Regeant | Company | Catalog No. | |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6×8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8×8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10×10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità |
Referências
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