En ny metod för Kultur och Polarized Stimulering av human tarmslemhinna Explants
Summary
Vi introducerar en ny metod för underhåll av human tarmslemhinna i kultur och övervakning av reaktionerna på olika typer av stimuli över åtminstone 24 timmar. Med vår metod, är polariteten av vävnaden bibehålls, vilket möjliggör en fysiologisk stimulering via apikala rutten.
Abstract
Några modeller finns för närvarande att realistiskt simulera den komplexa mänskliga tarmen s mikro-miljö, där en mängd olika interaktioner äger rum. Korrekt homeostas beror direkt på dessa interaktioner, eftersom de forma en hel immunologisk tolerans svar inducerar mot livsmedel antigener medan samtidigt montera effektiva immunsvar mot patogena mikrober misstag intas med mat.
Intestinal homeostas upprätthålls också genom olika komplexa interaktioner mellan mikroorganismer (inklusive mat-associerade nyttiga bakteriestammar) och värden, som reglerar den bifogade filen / nedbrytning av slem, produktion av antimikrobiella peptider genom epitelbarriären, och "utbildning" av epitelceller "som styr tolerogena eller immunogena fenotyp av unika, gut bosatta lymfoidceller befolkningar. Dessa interaktioner har hittills mycket svårt att reproducera med in vitro-analyseranvändning av antingen odlade cellinjer eller perifera mononukleära blodceller. Dessutom musmodeller skiljer sig avsevärt i delar av tarmslemhinnan (slemlager organisation, bakteriefloran gemenskap) med avseende på den mänskliga tarmen. Således har studier av en mängd olika behandlingar för att föras på klinikerna för viktiga stressrelaterade eller patologiska tillstånd såsom colon irritabile, inflammatorisk tarmsjukdom eller kolorektal cancer varit svårt att genomföra.
För att hantera dessa frågor, har vi utvecklat ett nytt system som gör det möjligt för oss att stimulera explantat av human tarmslemhinna som har kvar sin in situ konditionering av värdens mikroorganismer och immunförsvar, i ett polariserat sätt. Polarized apikal stimulering är av stor betydelse för resultatet av den framkallade immunsvaret. Det har upprepade gånger visat att samma stimuli kan ge helt olika svar när de förbi den apikala ytan av intestinala epithelium, stimulerar epitelceller basolaterally eller kommer i direkt kontakt med komponenter lamina propria, byta fenotypen från tolerogena till immunogena och orsakar onödig och överdriven inflammation i området.
Vi uppnådde polariserad stimulering genom limning en grotta cylinder som avgränsas området av stimulering på den apikala ytan av slemhinnan som kommer att beskrivas i protokollet. Vi använde den här modellen för att undersöka, bland annat, differentiella effekter av tre olika laktobaciller stammar. Vi visar att denna modell systemet är väldigt kraftfullt att bedöma immunmodulerande egenskaper av probiotika på friska och sjukdomstillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behovet av fysiologiskt relevanta modeller på vilka behandlingar för human tarmslemhinna kan giltigt testas har länge betonat. Många forskare har identifierat potentiella artefakter och defekter i både cell 5 och modeller mus 6 som hittills använts för detta ändamål. Även om den lovande prekliniska data erhålls ofta, dessa översätter sällan betydande kliniska fördelar.
Den metod som beskrivs i detta arbete presenterar en relativt enkel, men effektiv och r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Erika Mileti för utmärkt teknisk support och Dr Antonio Di Sabatino för att ge syre kamrarna.
Finansiering: Detta arbete har finansierats med bidrag från EU: s 7 ramprogram (IBDase, ERC: Dendroworld) och Fondazione Cariplo till MR och stöd genom ett Marie Curie internationell utbildning rörlighet nätverk (överhörning, bidragsavtal nr: 21.553-2) till KT.
Materials
| Regeant | Company | Catalog No. | |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6×8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8×8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10×10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità |
Referências
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?. Gut Microbes. , (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology–a review. Int. J. Food Microbiol. 141, S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
