בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center,Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center,Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran
Summary
השיטה מתוארת בידוד ואפיון של תאי גזע אנושיים שיניים זולות (hDPSCs) באמצעות אחת<strong> דיסוציאציה האנזימטית של עיסה (DPSC-ED)</strong> או<strong> תולדה ישירה של תאי גזע מרקמת explants עיסה (DPSC-OG). לאחר מכן על ידי</strong><em> במבחנה</em> בידול השוואתי של שני סוגי hDPSCs לodontoblasts.
Abstract
<p class="jove_content"> שיני בינה מתפתחת הן מקור קל נגיש של תאי גזע במהלך הבגרות שלא ניתן להשיג על ידי טיפולים אורתודונטים שיגרתי. תאי גזע המופקים מעיסת אנוש (hDPSCs) ניחן בפוטנציאל התפשטות גבוהה עם יכולת בידול רבת שושלת להשוות למקור הרגיל של תאי גזע בוגרים<sup> 1-8</sup>, ולכן hDPSCs יכול להיות המועמדים הטובים להשתלה עצמית בהנדסת רקמות ורפואת רגנרטיבית. בנוסף ליתרונות אלה, המחזיק את תאי גזע (mesenchymal MSC) תכונות, כגון השפעת immunolodulatory, להפוך hDPSCs יקר יותר, גם במקרה של השתלת שתל<sup> 6,9,10</sup>. לכן, הצעד הראשון לשימוש במקור זה לתאי גזע הוא לבחור את הפרוטוקול הטוב ביותר לבידוד hDPSCs מרקמות עיסה. על מנת להשיג מטרה זו, היא חיוני כדי לחקור את ההשפעה של תנאי בידוד שונים על התנהגויות סלולריות שונות, כגון סמניהם המשותפים השטח וגם יכולת ההתמיינות שלהם.</p><p class="jove_content"> לכן, כאן אנו מפרידים רקמות עיסה אנושיות משיניים טוחנות 3 השפיעו עליהם, ולאחר מכן השתמשנו בשני פרוטוקולים קיימים המבוססים על ספרות, לhDPSCs המבודד,<sup> 11-13</sup><em> כלומר</em> דיסוציאציה האנזימטית של רקמת עיסה (DPSC-ED) או תולדה מexplants רקמות (DPSC-OG). מבחינה זו, ניסו להקל על שיטות הבידוד באמצעות דיסק יהלום שיניים. לאחר מכן, תאים אלה מתאפיינים במונחים של סמנים הקשורים סטרומה (CD73, CD90, CD105 & CD44), סמני hematopoietic / אנדותל (CD34, CD45 & CD11b), סמן perivascular, כמו CD146 וגם stro-1. לאחר מכן, בשני פרוטוקולים אלה הושוו מבוססים על עצמת הבידול לodontoblasts ידי שניהם תגובת שרשרת פולימראז כמותית (QPCR) וכתמים אדומים אליזרין. QPCR שמש להערכה של הביטוי של גנים הקשורים למינרליזציה (phosphatase אלקליין; ALP, phosphoglycoprotein התאי מטריקס; MEPE & דנטין sialophosphoprotein; DSPP).<sup> 14</sup</p>
Introduction
תאי גזע הם תאי clonogenic אשר מחזיקים שתי תכונות יוצאות דופן, הידועים כ- עצמה רבה והתחדשות עצמית 15. בין כל תאי גזע עם פוטנציות replicative שונות, תאי גזע שיניים כתאי גזע לאחר הלידה יכולים לעורר תשומת לב בשנים האחרונות בגלל הנגישות שלהם, הפלסטיות, ויכולת שגשוג גבוהה בהשוואה לתאי גזע בוגרים אחרים 16. אופייני, בדומה לתאי גזע mesenchymal, תאי גזע הם תאי עיסת שיני clonogenic חסיד שבו יש יכולת המרובה בידול לmesenchyme ו / או שושלות אינן mesenchyme, היא במבחנת in vivo. 1-8,17,18 DPSCs מזוהים על ידי הביטוי שלהם השלילי של אנטיגנים hematopoietic (למשל, CD45, CD34, CD14), וביטוי חיובי של CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 וstro-1. 19,20
פוטנציאל להשיג קל עם כאבים ותחלואה מינימאליים לעשות DPSCs אדם כvaluמקור של תאי גזע מסוגל בהשוואה למקורות הרגילים, כגון תאי מח עצם mesenchymal גזע 21. באופן כללי, DPSCs היה מבודד על ידי אף אחת משיטות תולדה, כלומר, הגירה של תאי גזע מרקמת explants עיסה (DPSC-OG) 22-24, ו / או על ידי עיכול אנזימטי (DPSC-ED) 4,6,25. המחקרים קודמים הראו כי תנאי תרבות שיטת בידוד ויכולים לגרום לאוכלוסיות או שושלות שונות תחת במעברי המבחנה 26,27. במקרה של שיניים קבועות (pDPSCs), הואנג ואח' גילה כי pDPSCs מתעכל אנזימטית יש פוטנציאל התפשטות גבוהה יותר בהשוואה לDPSCs נחלץ מהם. 26 יתר על כן, במקרה של שיניים נשירות (dDPSCs), היא ההוכחה שstro-1 & CD34 סמנים הביעו יותר בdDPSC-ED בהשוואת dDPSC-OG. בנוסף, dDPSC-ED מוצג שיעור מינרליזציה גבוהה במדיום מוגדר osteo / odonto 27. לכן, בשל הפוטנציאל יוצא הדופן של DPSCs בrרפואת egenerative, מחקרים נוספים תידרש להבנה טובה יותר של אוכלוסיות שונות אפשריות אשר נגזרות משיטות בידוד שונות.
הנה, זה היה ניסיון להציג את הדרך קלה להפקת עיסה, באמצעות דיסק יהלום שיני צעד אחד כדי להקל על התהליך של מיצוי עיסה. יתר על כן, לאחר הבידוד של תאי גזע המופקים מעיסת אדם על ידי שימוש בשיטות ED או OG, תכונות כלליות ויכולת הבחנה בין שתי קבוצות היו גם נחקרו.
Protocol
1. הכן את פתרון אנזימים ובינוני הפצה (PM) הפוך סוג collagenase פתרון: תשקול את collagenase סוגי (12 מ"ג / מ"ל) ולהתמוסס במ"ל PBS 1 ומסנן באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. ואז למקם אותו צינור מ"ל 15 ולשמור אותו ב -20 ° C עד צורך. …
Representative Results
DPSCs שהתקבלו על ידי ניתוק האנזימטית (DPSC-ED) מוצגות כאן ביום 10, 15,18 (איור 1). המושבות יזמו להיוצר על כמעט 3 עד 5 ימים לאחר הבידוד. DPSCs outgrown (DPSC-OG) מוצג באיור 2 ביום 5, 10, 13 & 18. פיברובלסטים דמויי תאים החלו להגר מרקמות עיסה …
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את התהליך של בידוד ואפיון של hDPSCs מעיסת שיניים באמצעות שתי שיטות, דיסוציאציה האנזימטית ותולדה ישירה של תאי גזע מרקמת explants עיסה. בנוסף, בבידול במבחנה של תאים אלו לתוך odontoblasts, הוערך על ידי assay & S QPCR כמותית אליזרין האדום.
<p class="jove_content" style=";text-align:righ…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים תודה ד"ר ליילה Shakeri & ד"ר עארף Dournaei לדיסקוסם הקריטי ומר מוחמד רזא Khadem שריף לתומך הטכני שלו.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue or Lot. number | Comments (optional) |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 |
Referências
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
- Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
- Graziano, A., d’Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
- Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
- Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
- Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
- Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
- de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
- Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
- Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
- Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
- Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
- Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
- Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
- Graziano, A., et al. Scaffold’s surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
- d’Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
- Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
- Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
- Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
- About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
- Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
- Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
- Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
- d’Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
- Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).
Tags
IsolationCharacterizationComparative DifferentiationHuman Dental Pulp Stem CellsPermanent TeethTwo Different MethodsWisdom TeethRoutine Orthodontic TreatmentsHDPSCsProliferation PotentialMulti-lineage Differentiation CapacityAutologous TransplantationRegenerative MedicineMesenchymal Stem CellsMSC FeaturesImmunomodulatory EffectAllograft TransplantationIsolation ConditionsSurface MarkersDifferentiation CapacityImpacted Third Molar TeethDental Diamond Disk
Citar este artigo
Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods. J. Vis. Exp. (69), e4372, doi:10.3791/4372 (2012).