निमेटोड में शारीरिक आकार विनियमन में शामिल जीनों के लिए स्क्रीन के लिए आरएनए की मध्यस्थता हस्तक्षेप दूध पिलाने की रणनीति का प्रयोग कर<em> सी. एलिगेंस</em
Summary
हम प्रदर्शन कैसे आरएनएआई खिला तकनीक का उपयोग करने के लिए नीचे में लक्ष्य जीन और स्कोर शरीर के आकार के phenotype दस्तक<em> सी. एलिगेंस</em>. इस विधि एक बड़े पैमाने स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए ब्याज की संभावित आनुवंशिक शरीर DBL-1/TGF-β संकेतन द्वारा विनियमन आकार में शामिल उन लोगों के रूप में इस तरह के घटकों की पहचान.
Abstract
डबल किनारा हस्तक्षेप आरएनए की मध्यस्थता (आरएनएआई) एक प्रभावी रणनीति के लिए नीचे लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 1-3 दस्तक है. यह संयंत्र अकशेरूकीय और रीढ़ सहित कई मॉडल प्रणाली को लागू किया गया है. 4,5 vivo में आरएनएआई को प्राप्त करने के विभिन्न तरीके हैं. उदाहरण के लिए, लक्ष्य जीन एक आरएनएआई वेक्टर के रूप में तब्दील किया जा सकता है, और फिर या तो स्थायी रूप से या transiently सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं जीन पछाड़ना प्रभाव को प्राप्त करने में तब्दील, वैकल्पिक रूप से विशिष्ट लक्ष्य जीन (आरएनएआई oligos) से डबल भूग्रस्त oligonucleotides संश्लेषित transiently हो सकता है सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं को लक्ष्य जीन चुप्पी में तब्दील हो, या संश्लेषित डबल भूग्रस्त आरएनए अणुओं एक जीव में microinjected किया जा सकता है. चूंकि निमेटोड सी. एलिगेंस एक खाद्य स्रोत के रूप में बैक्टीरिया का उपयोग करता है, बैक्टीरिया लक्ष्य जीन के खिलाफ डबल भूग्रस्त आरएनए व्यक्त के साथ पशुओं को खिला एक व्यवहार्य 6 रणनीति प्रदान करता है. यहाँ हम एक आरएनएआई खिला मौजूदविधि शरीर के आकार phenotype स्कोर करने के लिए. सी. में शारीरिक आकार एलिगेंस TGF-β द्वारा मुख्य रूप से नियंत्रित किया जाता है की तरह ligand DBL-1, तो इस परख TGF-बीटा संकेत 7 घटकों की पहचान के लिए उपयुक्त है. हम दो आरएनएआई अत्यंत अनुभुत आरएनएआई खिला प्रयोगों दोहराने उपभेदों सहित अलग अलग उपभेदों का इस्तेमाल किया. हमारे नतीजे बताते हैं कि तनाव rrf-3 हमें सबसे अच्छा उम्मीद आरएनएआई phenotype दिया. विधि प्रदर्शन करने के लिए आसान है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और आसानी से मात्रा निर्धारित है. इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल विशेष उपकरणों का उपयोग कम से कम है, तो यह छोटी प्रयोगशालाओं या मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में उन लोगों के लिए उपयुक्त है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम शरीर सी. के आकार दोषपूर्ण म्यूटेंट के पहचान के लिए हमारे विधि का वर्णन आरएनएआई खिला द्वारा एलिगेंस. इस विधि TGF-बीटा संकेत घटकों की पहचान करने के लिए लागू है. चूंकि ऐसे घटकों अत्…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विभिन्न विकासात्मक समय अंक पर पशुओं के आंकड़े उपलब्ध कराने के लिए जेम्स क्लार्क सी. धन्यवाद. इस अध्ययन में एलिगेंस उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर, जो अनुसंधान संसाधन के लिए NIH राष्ट्रीय केंद्र (NCRR) द्वारा समर्थित है से प्राप्त किया गया. यह काम 1817 CIRG CUNY से जीएल और सीएसडी समर्थित किया गया था, और NIH 1R15GM073678-01 और सीएसडी के लिए 1R15GM097692-01 के द्वारा हम पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए डॉ. विलियम जे चावल, डॉ. Nathalia Holtzman, और मेलिस्सा Silvestrini धन्यवाद. न्यूयॉर्क के सिटी विश्वविद्यालय (एस Xiong) के ग्रेजुएट केंद्र से पीएचडी की डिग्री के लिए आवश्यकताओं की आंशिक पूर्ति में इस काम से बाहर किया गया था.
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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