El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em> C. elegans</em

Summary

Se demuestra cómo utilizar la técnica de alimentación RNAi para derribar los genes diana y el fenotipo puntuación en el tamaño del cuerpo<em> C. elegans</em>. Este método podría ser utilizado para una pantalla de gran escala para identificar los posibles componentes genéticos de interés, tales como los implicados en la regulación del tamaño del cuerpo por la señalización de DBL-1/TGF-β.

Abstract

Haga doble cadena de ARN mediada por interferencia (ARNi) es una estrategia efectiva para derribar objetivo de la expresión génica ^1-3. Se ha aplicado a muchos sistemas modelo incluyendo plantas, invertebrados y vertebrados. Hay varios métodos para lograr la RNAi in vivo ^4,5. Por ejemplo, el gen diana puede ser transformado en un vector de ARNi, y a continuación, ya sea permanentemente o transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias para lograr los efectos de genes desmontables; alternativamente sintetizarse oligonucleótidos de doble cadena a partir de genes diana específicos (RNAi oligos) puede ser transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias de silenciar genes diana, o sintetizado de doble filamento moléculas de ARN puede microinyectarse en un organismo. Desde el nematodo C. elegans utiliza bacterias como fuente de alimento, la alimentación de los animales con bacterias que expresan ARN de cadena doble contra genes diana proporciona una estrategia viable ^6. A continuación les presentamos una alimentación RNAimétodo de anotar el tamaño del cuerpo fenotipo. Tamaño del cuerpo en C. elegans está regulada principalmente por el TGF-β – ligando como DBL-1, por lo que este método es apropiado para la identificación de TGF-β componentes de señalización ^7. Utilizamos diferentes cepas incluyendo dos cepas RNAi hipersensibilidad a repetir los experimentos de alimentación RNAi. Nuestros resultados mostraron que la FRR-3 cepa nos dio el mejor esperada fenotipo RNAi. El método es fácil de realizar, reproducible, y se cuantifica fácilmente. Por otra parte, el protocolo minimiza el uso de equipo especializado, por lo que es adecuado para laboratorios pequeños o aquellos en instituciones predominantemente de licenciatura.

Protocol

1. Preparación de las placas de RNAi de alimentación que llevan la secuencia del gen diana Si se utilizan las bibliotecas RNAi disponibles comercialmente (por ejemplo, de LifeSciences Fuente BioScience), vaya al paso 1.4. Alternativamente, clonar secuencias de genes diana en el vector L4440, un gusano utiliza comúnmente RNAi plásmido 8, por el protocolo de clonación. Transformar el plásmido recombinante en la cepa bacteriana HT115 (DE3), cultivarlas en placas de agar LB con…

Representative Results

En nuestra investigación, nos centramos en el tamaño corporal regulación por la vía DBL-1/TGF-β. La pérdida de función de los resultados vía DBL-1 en el tamaño corporal pequeño, como una longitud de cuerpo más corto en comparación con el de tipo salvaje animales 7,10,11. Así, las pantallas de C. elegans mutantes tamaño del cuerpo son capaces de identificar TGF-β componentes de señalización y modificadores. DBL-1 de señalización está mediada por una conservadas TGF-β vía de trans…

Discussion

En este protocolo, describimos nuestro método para la identificación de mutantes defectuosos tamaño corporal de C. elegans por alimentación RNAi. Este método es aplicable a la identificación de los componentes de señalización de TGF-β. Puesto que tales componentes están altamente conservadas a través de la evolución ^15, tales pantallas son relevantes para elucidar los mecanismos moleculares de la señalización de TGF-β en todos los metazoos. Una consideración importante en el diseño d…

Materials

RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick