Använda RNA-medierad strategi Interference Matning att screena för gener involverade i kroppsstorlek förordningen i rundmasken<em> C. elegans</em
Summary
Vi visar hur man använder RNAi utfodring teknik för att slå ner målgener och poäng kroppsstorlek fenotyp i<em> C. elegans</em>. Denna metod kan användas för en storskalig skärm för att identifiera potentiella genetiska komponenter av intresse, såsom de som är inblandade i kroppsstorlek reglering av DBL-1/TGF-β signalering.
Abstract
Dubbelsträngat RNA-medierad interferens (RNAi) är en effektiv strategi för att slå ner mål 1-3 genuttryck. Det har använts i många modellsystem, inklusive växter, ryggradslösa djur och ryggradsdjur. Det finns olika metoder för att uppnå RNAi in vivo 4,5. Till exempel kan målgenen omvandlas till en RNAi vektor, och sedan antingen permanent eller tillfälligt omvandlas till cellinjer eller primära celler för att uppnå effekter gen knockdown, alternativt syntetiserade dubbel tråd oligonukleotider från specifika målgener (RNAi oligos) kan tillfälligt omvandlas till cellinjer eller primära celler att tysta målgener, eller syntetiserade dubbelsträngade RNA-molekyler kan mikroinjiceras i en organism. Eftersom nematoden C. elegans använder bakterier som en näringskälla, utfodra djuren med bakterier som uttrycker dubbelsträngat RNA mot målgener ger en hållbar strategi 6. Här presenterar vi en RNAi utfodringmetod att göra mål fenotyp kroppsstorlek. Kroppsstorlek i C. elegans regleras primärt av TGF-β – liknande ligand DBL-1, så denna analys är lämplig för identifiering av TGF-β signalering komponenter 7. Vi använde olika stammar, inklusive två RNAi överkänsliga stammar att upprepa de RNAi utfodring experiment. Våra resultat visade att RRF-3-stammen gav oss den bästa förväntade RNAi fenotyp. Metoden är enkel att utföra, reproducerbar, och lätt kvantifieras. Dessutom minimerar vår protokoll att använda specialutrustning, så det är lämpligt för mindre laboratorier eller de vid övervägande grundutbildningen institutioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskriver vi vår metod för identifiering av defekta kroppsstorlek mutanter av C. elegans by RNAi utfodring. Denna metod är lämplig för identifikation av TGF-β signalering komponenter. Eftersom sådana komponenter är högkonserverade genom evolutionen 15, sådana skärmar är relevanta att belysa de molekylära mekanismerna av TGF-β signalering i alla metazoans. Ett viktigt övervägande vid utformningen av en sådan skärm är utgångspunkten stammen. Vi har visat att både …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar James Clark för att ge siffror djur vid olika utvecklings tidpunkter. C. elegans stammar i denna studie erhölls från Caenorhabditis Genetics Center, som stöds av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Detta arbete stöddes av CIRG 1817 från CUNY till JL och CSD, samt NIH 1R15GM073678-01 och 1R15GM097692-01 till CSD Vi tackar Dr William J Rice, Dr Nathalia Holtzman, och Melissa Silvestrini för kommentarer på manuskriptet. Detta arbete utfördes i delvis uppfylla kraven för doktorsexamen från Graduate Center på City University i New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
Referências
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
