Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações
Summary
Um método através do qual a expressão do gene no tubo neural pode ser downregulated em um tipo de célula específico forma rastreável é descrito. Demonstramos como<em> In ovo</em> Electroporação de microRNA baseados em plasmídeos que eliciam espaço-temporalmente controlada RNA de interferência pode ser utilizada para investigar a orientação do axónio comissural no tubo neural em desenvolvimento.
Abstract
Comissurais ED1 neurônios têm sido extensivamente estudadas para elucidar os mecanismos subjacentes a orientação axônio durante 1,2 desenvolvimento. Esses neurônios estão localizados na medula espinhal dorsal e enviar seus axônios ao longo de trajetórias estereotipados. Axônios comissurais inicialmente projetar ventralmente para e, em seguida, do outro lado da placa ventral. Depois de cruzar a linha média, esses axônios fazer uma curva acentuada rostral e projeto longitudinalmente para o cérebro. Cada uma dessas etapas é regulado pelas atividades coordenadas de pistas de orientação atrativas e repulsivas. A correta interpretação dessas pistas é fundamental para a orientação dos axônios ao longo de seu percurso demarcado. Assim, a contribuição fisiológica de uma molécula particular de orientação encontra-se idealmente axônio comissural investigado no contexto do embrião vivo. Por conseguinte, knockdown gene in vivo devem ser controlados com precisão, a fim de distinguir cuidadosamente actividades de orientação de axónios de genes que podem desempenhar múltiplaspapéis durante o desenvolvimento.
Aqui, nós descrevemos um método para a expressão do gene knockdown no tubo neural galinha em uma célula de tipo específico forma rastreável. Usamos novos vectores plasmídicos 3 abrigar células específicas do tipo promotores / intensificadores que dirigem a expressão de um marcador de proteína fluorescente, seguido directamente por uma transcrição miR30 RNAi-4 (localizado dentro da 3'-UTR do ADNc que codifica para a proteína fluorescente) ( Figura 1). Quando electroporado para dentro do tubo neural em desenvolvimento, estes vectores de eliciar downregulation eficaz da expressão do gene e expressar proteínas marcadoras fluorescentes brilhantes para permitir o rastreio directo das células experimentam knockdown 3. Misturando diferentes vetores de RNAi antes da electroporação permite que o knockdown simultânea de dois ou mais genes de regiões independentes da medula espinhal. Isto permite complexas interacções celulares e moleculares a serem examinados durante o desenvolvimento, de um modo que é rápido, sim, preciso e de baixo custo. Em combinação com Dil rastreamento de trajetórias axônios comissurais em livro aberto preparações 5, este método é uma ferramenta útil para estudos in vivo dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio comissural e orientação. Em princípio, qualquer promotor / intensif icador poderiam ser utilizados, o que poderia tornar a técnica mais extensamente aplicável para estudos de vivo da função do gene durante o desenvolvimento 6.
Este primeiro vídeo demonstra como manipular e ovos de janela, a injecção de plasmídeos de ADN para dentro do tubo neural e do procedimento de electroporação. Para investigar orientação axônio comissural, a medula espinhal é retirado do embrião como uma preparação de livro aberto, fixo, e injetado com Dil para permitir percursos de axónios a ser traçada. A medula espinal é montado entre lamelas e visualizadas por microscopia confocal.
Protocol
Discussion
Esta simples, baseado em vectores de expressão artificial miRNA estratégia pode ser usada para knockdown expressão do gene endógeno no tubo neural frango. Estas ferramentas funcionais oferecer silenciamento de genes múltiplos, o controlo temporal e especificidade do tipo de célula, a fim de facilitar a elucidação das complexas vias de desenvolvimento. Em particular, foi demonstrado a utilidade destes plasmídeos em orientação axon comissural, uma vez que os plasmídeos podem ser usados para genes distint…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho no laboratório do ES é apoiado pela National Science Foundation suíço. Gostaríamos de agradecer ao Dr. batida Kunz para a assistência com as filmagens.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
Referências
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