En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l'évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs
Summary
Procédé par lequel l'expression du gène dans le tube neural peut être régulée à la baisse dans une cellule spécifique d'un type, est décrit de façon traçable. Nous montrons comment<em> In ovo</emÉlectroporation> des microARN à base de plasmides qui suscitent spatio-temporellement contrôlée ARN interférence peut être utilisée pour étudier le guidage axonal commissurale dans le tube neural développement.
Abstract
Commissuraux EL1 neurones ont été étudiés afin d'élucider les mécanismes qui sous-tendent le guidage axonal pendant 1,2 développement. Ces neurones sont situés dans la moelle épinière dorsale et envoient leurs axones le long de trajectoires stéréotypées. Axones commissuraux d'abord projeter vers le ventre, puis à travers la plaque de sol. Après avoir traversé la ligne médiane, ces axones faire un virage serré rostrale et le projet longitudinalement vers le cerveau. Chacune de ces étapes est régie par les activités coordonnées de signaux de guidage attractives et répulsives. L'interprétation correcte de ces signaux est essentielle pour guider les axones le long de leur parcours délimité. Ainsi, la contribution d'une molécule physiologique particulier pour le guidage axonal commissure est idéalement étudiée dans le cadre de l'embryon vivant. En conséquence, inactivation génique in vivo doit être contrôlée avec précision afin de bien distinguer les activités de guidage des axones des gènes qui pourraient jouer multiplerôles au cours du développement.
Nous décrivons ici une méthode pour l'expression des gènes effet de choc dans le tube neural de poulet dans une cellule spécifique du type, de façon traçable. Nous utilisons de nouveaux vecteurs plasmidiques 3 Hébergement cellulaires spécifiques au type de promoteurs / amplificateurs qui alimentent l'expression d'un marqueur fluorescent protein, suivie directement par une transcription miR30-RNAi 4 (situé au sein de la 3'-UTR de l'ADNc codant pour la protéine fluorescente) ( Figure 1). Lorsque électroporation dans le tube neural en développement, ces vecteurs susciter la régulation négative de l'expression génique efficace et d'exprimer vives protéines marqueurs fluorescents pour permettre le traçage directe des cellules qui connaissent knockdown 3. Mélanger différents vecteurs d'ARNi avant l'électroporation permet l'effet de choc simultanée de deux ou plusieurs gènes dans les régions indépendantes de la moelle épinière. Cela permet de complexes interactions cellulaires et moléculaires qui seront examinées au cours du développement, d'une manière qui est rapide, smise, précis et peu coûteux. En combinaison avec Dil tracé des trajectoires des axones dans commissurales à livre ouvert préparations 5, cette méthode est un outil utile pour les études in vivo des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance axonale commissurale et d'orientation. En principe, n'importe quel promoteur / amplificateur peut être utilisé, ce qui pourrait rendre la technique plus largement applicable pour les études in vivo de la fonction des gènes au cours du développement 6.
Cette vidéo montre d'abord comment manipuler et oeufs de fenêtres, l'injection de plasmides d'ADN dans le tube neural et la procédure d'électroporation. Pour étudier le guidage axonal commissurale, la moelle épinière est enlevée de l'embryon comme une préparation à livre ouvert, fixé, et injecté avec Dil pour permettre voies axonales à tracer. La moelle épinière est monté entre lamelles et visualisées par microscopie confocale.
Protocol
Discussion
Cette simple, basée sur un vecteur d'expression artificielle stratégie miRNA peut être utilisé pour l'expression du gène endogène effet de choc dans le tube neural poulet. Ces outils fonctionnels offrent gene silencing multiple, contrôle temporel et une spécificité de type cellulaire, afin de faciliter l'élucidation des voies de développement complexes. En particulier, nous avons démontré l'utilité de ces plasmides dans le guidage axonal commissurale, depuis les plasmides peuvent être util…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Travail dans le laboratoire de l'ES est soutenu par le Fonds national suisse de la science. Nous tenons à remercier le Dr Beat Kunz de l'aide pour le tournage.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
Referências
- Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
- Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Development. 4, 21 (2009).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development. Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).
- Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Biologia do Desenvolvimento. 294, 554-563 (2006).
- Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo. Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29, 123-132 (2001).
- Kieleczawa, J. Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats. Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo. J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).
- Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices. Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).
- Murphy, M. C., Fox, E. A. Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract. Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Li, X., Lufkin, T. Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III. Genesis. 26, 121-122 (2000).
- Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).
- Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods. 3, 677-681 (2006).
