In ovo Elektroporation von miRNA-basierte Plasmide in der Entwicklung von Neuralrohr und Beurteilung der Phänotypen von DiI Injection in Open-book Vorbereitungen
Summary
Ein Verfahren, durch welches die Genexpression in der Neuralrohr sein herunterreguliert kann in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar beschrieben. Wir zeigen, wie<em> In ovo</em> Elektroporation von microRNA-basierte Plasmide, raumzeitlich kontrollierten RNA-Interferenz auslösen kann verwendet werden, um commissural Axon Führung in der Entwicklung von Neuralrohrdefekten zu untersuchen.
Abstract
Kommissuralen dI1 Neuronen wurden ausführlich untersucht, um die zugrunde liegenden Mechanismen Axon Führung während der Entwicklung 1,2 aufzuklären. Diese Neuronen sind im dorsalen Rückenmark und schicken ihre Axone entlang stereotype Bahnen. Kommissuralen Axone zunächst ventral projizieren Richtung und dann über der Bodenplatte. Nach dem Überqueren der Mittellinie, machen diese Axone eine scharfe rostral Turn und Projekt längs zum Gehirn. Jeder dieser Schritte wird durch die koordinierte Tätigkeit der anziehenden und abstoßenden Signalmoleküle reguliert. Die richtige Interpretation dieser Signale ist entscheidend für die Führung von Axonen entlang ihrer abgegrenzten Weg. Somit wird die physiologische Beitrag eines bestimmten Moleküls zu kommissuralen Axon Führung idealerweise im Rahmen des lebenden Embryo untersucht. Dementsprechend müssen Gen knockdown in vivo exakt gesteuert werden, um sorgfältig zu unterscheiden Axon Führung Aktivitäten von Genen, die spielen möglicherweise mehrereRollen während der Entwicklung.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Knockdown Genexpression im Huhn Neuralrohr in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar. Wir verwenden neuartige Plasmidvektoren 3 beherbergen zelltypspezifischen Promotoren / Enhancer, die die Expression eines Fluoreszenzprotein-Marker anzutreiben, direkt gefolgt von einer miR30-RNAi-Transkript 4 (die sich in dem 3'-UTR von der cDNA, die das fluoreszierende Protein) ( Abbildung 1). Wenn in den Entwicklungsbehälter Neuralrohr elektroporiert, hervorzurufen diese Vektoren effiziente Herunterregulation der Genexpression und exprimieren hell fluoreszierenden Marker Proteine ermöglichen die direkte Verfolgung der Zellen erleben Knockdown 3. Mischen verschiedener RNAi-Vektoren vor der Elektroporation erlaubt die gleichzeitige Knockdown von zwei oder mehreren Genen in unabhängigen Bereichen des Rückenmarks. Dies erlaubt komplexen zellulären und molekularen Wechselwirkungen während der Entwicklung untersucht werden, in einer Weise, die schnell, sUmsetzung, präzise und kostengünstig. In Kombination mit DiI Tracing von commissural Axon Trajektorien in Open-book-Präparate 5, ist diese Methode ein nützliches Werkzeug für die in-vivo-Studien der zellulären und molekularen Mechanismen der commissural Axonwachstum und Führung. Im Prinzip könnte jede Promotor / Enhancer verwendet werden, möglicherweise macht die Technik breiter anwendbar für in vivo Studien der Genfunktion während der Entwicklung 6.
Dieses Video zeigt, wie zu handhaben und Fenster Eier, die Injektion von DNA-Plasmiden in das Neuralrohr und die Elektroporation Verfahren. Um commissural Axon Führung zu untersuchen, wird das Rückenmark aus dem Embryo als Open-book-Präparation entfernt, fixiert und injiziert mit DiI zu ermöglichen Axon Wege zu verfolgen. Das Rückenmark wird zwischen Deckgläsern montiert und visualisiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie.
Protocol
Discussion
Diese einfache, vektorbasierten künstlichen miRNA Expressionsstrategie kann Knockdown endogenen Genexpression in dem Neuralrohr Huhn verwendet werden. Diese funktionale Tools bieten mehrere Gen-Silencing, zeitliche Steuerung und Zelltyp-Spezifität, die Aufklärung komplexer Entwicklungsverläufe zu erleichtern. Insbesondere haben wir die Brauchbarkeit dieser Plasmide in kommissuralen Axon Führung gezeigt, da die Plasmide können zur Knockdown verschiedenen Genen in kommissuralen Neuronen oder in ihren Zwischenziel, d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeit im Labor von ES wird durch die Swiss National Science Foundation unterstützt. Wir danken Herrn Dr. Beat Kunz für die Unterstützung bei Dreharbeiten zu danken.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
Referências
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