オープンブックの準備におけるDiIを注入による開発神経管と表現型の評価におけるmiRNAベースのプラスミドのインオボエレクトロで
Summary
神経管における遺伝子発現は、細胞型特異的、トレーサブルな方法でダウンレギュレートすることができる方法が記載されている。我々はどのように実証する<em卵内の></em時空間的に制御されたRNA干渉を惹起するマイクロRNAベースのプラスミドの>エレクトロポレーションは、途上神経管における交連軸索ガイダンスを調査するために使用することができます。
Abstract
DI1交連ニューロンは広範囲に開発1,2の間に軸索ガイダンスのメカニズムを解明するために研究されてきた。これらのニューロンは脊髄背側に位置し、紋切り型の軌跡に沿ってその軸索を送っています。交連軸索は、最初は腹側に向かって、その後floorplate渡って投影します。正中線を越えた後、これらの軸索は、長手方向に向かって鋭い脳吻側ターンして、プロジェクトを作成します。これらの各手順は、魅力と反発指導の手がかりの協調活動によって規制されています。これらの手がかりの正しい解釈は、その区画経路に沿って軸索の指導のために重要である。したがって、交連軸索ガイダンスに特定の分子の生理的貢献は、理想的に生きている胚の文脈で検討されている。したがって、in vivoでの遺伝子ノックダウンを正確に慎重に複数プレイしてもよい遺伝子の軸索ガイダンス活動を区別するために制御されなければならない開発時の役割。
ここでは、細胞型特異的、トレーサブルな方法で、チキン神経管におけるノックダウン遺伝子発現にメソッドを記述します。我々は、小説のプラスミドベクターの蛍光タンパク質マーカーの発現を駆動する3形質細胞型特異的プロモーター/エンハンサーを使用し、miR30-RNAiのトランスクリプト4（コードするcDNAの3'-UTR内の蛍光タンパク質にあります）により直接続く（ 図1）。開発神経管にエレクトロとき、これらのベクターは、遺伝子発現の効率的なダウンレギュレーションを誘発し、ノックダウン3を経験した細胞のトレースを直接有効にする明るい蛍光マーカータンパク質を発現している。エレクトロポレーションの前に別のRNAiベクターを混合することにより、脊髄の独立した領域内の2つ以上の遺伝子の同時ノックダウンすることができます。これにより、s、高速な方法で、開発中に検討するために、複雑な細胞と分子の相互作用を可能にする、実装、正確かつ安価。オープンブックの準備5の交連軸索軌道のDIIトレースとの組み合わせでは、このメソッドは、交連軸索の成長と指導の細胞および分子機構のin vivo研究のための便利なツールです。原則的に、任意のプロモーター/エンハンサーは、潜在的な技術をより広く適用開発6における遺伝子機能のin vivo研究のために作り、使用することができる。
このビデオでは、最初に処理する方法について説明して、ウィンドウの卵、神経管へのDNAプラスミドの注入、エレクトロポレーション手順。交連軸索ガイダンスを調査するために、脊髄は、固定されたオープンブックの準備として、胚から除去され、軸索経路をトレースできるようにするためにDIIで注入される。脊髄は、カバーガラスとの間に装着し、共焦点顕微鏡を用いて可視化されています。
Protocol
Discussion
この単純な、ベクトルベースの人工miRNA発現戦略は鶏神経管におけるノックダウン内在性遺伝子の発現に使用することができます。これらの機能のツールは、複雑な発達経路の解明を容易にするために、複数の遺伝子サイレンシング、時間的制御と細胞型特異性を提供します。プラスミドは交連ニューロンやそれらの中間目標、floorplate 3ノックダウンの異なる遺伝子を使用するこ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ESのラボの仕事はスイス国立科学財団によってサポートされています。我々は撮影の支援については博士ビートクンツに感謝したいと思います。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
Referências
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