RNA-seq Analyse af Transcriptomes i behandlet Thrombin-og humant kontrol Pulmonal mikrovaskulære endotelceller
Summary
Denne protokol udgør en komplet og detaljeret procedure at anvende RNA-seq, en kraftfuld næste generations DNA-sekventering teknologi, til at profilere transcriptomes i humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller med eller uden thrombin behandling. Denne protokol er generalisere til forskellige celler eller væv ramt af forskellige reagenser eller sygdomstilstande.
Abstract
Karakteriseringen af genekspression i celler via måling af mRNA-niveauer er et nyttigt redskab til at bestemme, hvordan den transkriptionelle maskineri af cellen påvirkes af eksterne signaler (f.eks narkotikabehandling), eller hvordan celler variere mellem en sund tilstand og en syg tilstand. Med fremkomsten og kontinuerlig finjustering af næste generation af DNA-sekventering teknologi, har RNA-sekventering (RNA-seq) blevet en stadig mere populær metode til transkriptomet analyse katalogisere alle arter af transkripter, til bestemmelse af transkriptionel struktur af alle udtrykte gener og kvantificere de ændrede ekspressionsniveauer af det samlede sæt af transkripter i en given celle, væv eller organisme 1,2. RNA-seq erstatter gradvist DNA microarrays som en foretrukken fremgangsmåde til transkriptomet analyse, fordi det har fordelene ved profilering af en komplet transkriptom, tilvejebringelse af en digital type datum (kopiantallet af et transkript) og ikke afhængig af nogen kendt genomisk fortløbendece 3.
Her præsenterer vi en komplet og detaljeret protokol til at anvende RNA-seq til profil transcriptomes i humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller med eller uden thrombin behandling. Denne protokol er baseret på vores seneste offentliggjorte undersøgelse med titlen "RNA-seq afslører Novel transkriptom af gener og deres isoformer i Human Pulmonal mikrovaskulære endotelceller behandlet med thrombin," 4, hvor vi med succes gennemført første komplette transkriptomet analyse af humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller behandlet med thrombin ved hjælp af RNA-seq. Det gav hidtil usete ressourcer til yderligere eksperimenter at få indblik i molekylære mekanismer bag trombinmedieret endotel dysfunktion i patogenesen af inflammatoriske tilstande, kræft, diabetes og hjerte-kar-sygdom, og giver potentielle nye leads til terapeutiske mål til disse sygdomme.
Den beskrivende tekst til denne protokoler opdelt i fire dele. Den første del beskriver behandlingen af humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller med thrombin og RNA isolation, kvalitet analyse og kvantificering. Den anden del beskriver bibliotek konstruktion og sekventering. Den tredje del beskriver dataanalyse. Den fjerde del beskriver en RT-PCR-validering assay. Repræsentative resultater af flere vigtige skridt vises. Nyttige tips eller forholdsregler for at øge succes i de vigtigste trin er tilvejebragt i Diskussion sektion. Skønt denne protokol anvender humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller behandlet med thrombin, kan det være generaliseres til profil transcriptomes i både pattedyr-og ikke-pattedyr-celler og i væv, der er behandlet med forskellige stimuli eller inhibitorer eller til sammenligningen transcriptomes i celler eller væv mellem en sund tilstand og en sygdomstilstand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vigtige skridt
RNA Håndtering: RNaser vil forringe selv de mest høj kvalitet RNA, derfor skal man være omhyggelig under isoleringen, opbevaring og anvendelse af RNA 10. Handsker er altid slidt for at forhindre forurening af RNaser fundet på menneskehænder. Handsker skal udskiftes ofte, især efter at røre huden, dørhåndtag eller andre almindelige overflader. Et sæt af pipetter bør være dedikeret udelukkende til RNA arbejde og alle tips og rør skal være R…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Stephen Kingsmore og Pediatric Genome Medicine Center på Børns Mercy Hospitaler og klinikker for brugen af deres computing klynger for vores dataanalyse, Illumina mark service team (Elizabeth Boyer, Scott Cook og Mark Cook) og teknisk konsulent team for deres hurtige svar og nyttige forslag om driften af den næste generation DNA-sekventering instrument, HiScanSQ, og datakvalitet analyse. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health Grant HL080042 (til SQY) og opstart fond og begavelse af Børns Mercy Hospitaler og klinikker, University of Missouri i Kansas City (til SQY).
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
Referências
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
