ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires
Summary
Ce protocole présente une procédure complète et détaillée à appliquer ARN-seq, une puissante technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, de transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est généralisable à différentes cellules ou des tissus affectés par différents réactifs ou états pathologiques.
Abstract
La caractérisation de l'expression des gènes dans les cellules via la mesure des niveaux d'ARNm est un outil utile pour déterminer comment la machinerie transcriptionnelle de la cellule est affectée par des signaux externes (traitement médicamenteux, par exemple), ou comment les cellules diffèrent entre un état sain et un état pathologique. Avec l'avènement et le raffinement continu de la technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, séquençage de l'ARN (ARN-seq) est devenue une méthode de plus en plus populaire de l'analyse du transcriptome de cataloguer toutes les espèces de transcriptions, de déterminer la structure de la transcription de tous les gènes exprimés et à quantifier les niveaux d'expression de l'évolution de l'ensemble total de transcrits dans une cellule donnée 1,2, tissu ou organisme. ARN-seq remplace progressivement les puces à ADN comme une méthode pratique pour l'analyse du transcriptome, car il a les avantages de profilage d'un transcriptome complet, offrant une donnée de type numérique (nombre de copies de la transcription) et ne comptez sur aucune séquentielle génomique connueCe 3.
Ici, nous présentons un protocole complète et détaillée à appliquer ARN-seq pour transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est basé sur notre étude publiée récemment intitulé «RNA-seq révèle transcriptome Novel des gènes et de leurs isoformes de l'homme dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traités par la thrombine," 4, dans lequel nous avons réussi a effectué la première analyse complète du transcriptome de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traité avec de la thrombine en utilisant l'ARN-seq. Elle a abouti à des ressources sans précédent pour de nouvelles expérimentations afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la thrombine dysfonction endothéliale dans la pathogénie des maladies inflammatoires, le cancer, le diabète et les maladies coronariennes, et fournit de nouvelles pistes potentielles pour cibles thérapeutiques pour ces maladies.
Le texte descriptif de ce protocoleest divisé en quatre parties. La première partie décrit le traitement de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec la thrombine et d'isolement d'ARN, analyse de la qualité et de quantification. La deuxième partie décrit la construction de bibliothèques et de séquençage. La troisième partie décrit l'analyse des données. La quatrième partie décrit un essai de validation par RT-PCR. Les résultats représentatifs de plusieurs étapes clés sont affichés. Conseils utiles ou les précautions à stimuler le succès dans les étapes clés sont fournis dans la section Discussion. Bien que ce protocole utilise de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traitées avec de la thrombine, elle peut être généralisée à transcriptomes de profil dans les deux cellules de mammifères et non mammifères et dans les tissus traités avec différents stimuli ou des inhibiteurs, ou pour comparer les transcriptomes dans des cellules ou des tissus entre un état de santé et un état de maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes clés
Manipulation d'ARN: RNases se dégrade, même les plus de haute qualité d'ARN, donc il faut faire attention lors de l'isolement, le stockage et l'utilisation de l'ARN 10. Les gants sont toujours portés afin de prévenir la contamination par des RNases trouvés sur les mains de l'homme. Les gants doivent être changés souvent, surtout après la peau toucher, les poignées de porte ou d'autres surfaces communes. Un ensem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Stephen Kingsmore et le Centre du génome pédiatrique Médecine des Hôpitaux de Mercy enfants et cliniques pour l'utilisation de leurs grappes de calcul pour l'analyse des données, Illumina équipe sur le terrain des services (Elizabeth Boyer, Scott Cook et Mark Cook) et technique équipe de consultants pour leurs réponses rapides et des suggestions utiles sur le fonctionnement de l'instrument ADN séquençage de prochaine génération, HiScanSQ et analyse de la qualité des données. Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de la santé Grant HL080042 (à SQY) et le démarrage du fonds de dotation et des hôpitaux pour enfants Mercy et Cliniques, Université du Missouri à Kansas City (à SQY).
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
Referências
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