RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen
Summary
Dieses Protokoll stellt eine vollständige und detaillierte Verfahren zur RNA-seq, eine leistungsstarke Next-Generation-DNA-Sequenzierung Technologie zum Profil Transkriptomen in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung anzuwenden. Dieses Protokoll ist generalisierbar verschiedenen Zellen oder Geweben von verschiedenen Reagenzien oder Krankheitszuständen befallen.
Abstract
Die Charakterisierung der Genexpression in Zellen über Messung der mRNA ist ein nützliches Werkzeug bei der Bestimmung, wie der transkriptionellen Maschinerie der Zelle von externen Signalen (zB Arzneimittelbehandlung) oder wie Zellen unterscheiden zwischen einem gesunden Zustand und einem erkrankten Zustand ist betroffen. Mit dem Aufkommen und kontinuierliche Weiterentwicklung der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Technologie hat RNA-Sequenzierung (RNA-seq) eine zunehmend beliebte Methode der Transkriptom-Analyse, um alle Arten von Transkripten zu katalogisieren, um die transkriptionelle Struktur aller exprimierten Gene zu ermitteln und zu quantifizieren die wechselnden Expressionsniveaus des gesamten Satzes von Transkripten in einer bestimmten Zelle, Gewebe oder Organismus 1,2. RNA-seq ersetzt nach DNA-Mikroarrays als bevorzugte Methode für die Transkriptom-Analyse, da sie die Vorteile der Profilierung eine komplette Transkriptom hat, ein digitales Typ Datum (Kopienzahl jeder transcript) und sich auf keine bekannten genomischen sequence 3.
Hier stellen wir eine vollständige und detaillierte Protokoll RNA-seq zum Profil Transkriptomen gelten in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung. Dieses Protokoll basiert auf unseren kürzlich veröffentlichten Studie mit dem Titel basiert "RNA-seq enthüllt Novel Transkriptom von Genen und deren Isoformen in Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin behandelt," 4, in denen wir erfolgreich durchgeführt die erste komplette Transkriptom-Analyse der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen behandelt mit Thrombin mittels RNA-seq. Es ergab beispiellose Ressourcen für weitere Experimente, um Einblicke in die molekularen Mechanismen, die Thrombin-vermittelte endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen, Krebs, Diabetes und koronare Herzkrankheit zu gewinnen, und bietet potenziellen neuen Leads für therapeutische Targets zu diesen Krankheiten.
Der beschreibende Text des Protokollsist in vier Teile gegliedert. Der erste Teil beschreibt die Behandlung von pulmonaler menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin und RNA-Isolation, Qualität Analyse und Quantifizierung. Der zweite Teil beschreibt Aufbau der Bibliothek und Sequenzierung. Der dritte Teil beschreibt die Analyse der Daten. Der vierte Teil beschreibt einen RT-PCR Validierung Assay. Repräsentative Ergebnisse von mehreren wichtigen Schritten angezeigt. Nützliche Tipps oder Hinweise auf zu Erfolg in wichtigen Schritten zu steigern sind in der Diskussion Abschnitt. Obwohl dieses Protokoll verwendet menschlichen pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen mit Thrombin behandelt wird, kann es sein, generalisierte zum Profil Transkriptomen in beiden Säuger und Nicht-Säuger-Zellen und in Geweben mit unterschiedlichen Stimuli oder Inhibitoren oder Transkriptomen in Zellen oder Geweben zwischen einem gesunden Zustand vergleichen behandelten und einen Krankheitszustand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wichtige Schritte
RNA Handhabung: RNasen sogar verschlechtern die meisten hochwertigen RNA, daher muss darauf bei der Isolierung, Lagerung und Verwendung von RNA 10 entnommen werden. Handschuhe sind immer getragen werden, um Verschmutzungen durch RNasen auf die menschliche Hände fanden verhindern. Handschuhe sollten häufig gewechselt werden, insbesondere nach dem Berühren der Haut, Türklinken oder anderen gängigen Oberflächen. Eine Reihe von Pipetten sollten au…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Stephen Kingsmore und die Kinderradiologie Genome Medicine Center im Kinderkrankenhaus Mercy Krankenhäuser und Kliniken danken für die Nutzung ihrer Computing-Cluster für unsere Datenanalyse, Illumina Außendienst (Elizabeth Boyer, Scott Cook und Mark Cook) und technische Berater-Team für die schnellen Antworten und Anregungen auf dem Lauf der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Instrument, HiScanSQ und Datenqualität Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health Grants HL080042 (um SQY) unterstützt und Start-up-Fonds und Ausstattung der Kinder Mercy Krankenhäuser und Kliniken, University of Missouri in Kansas City (auf SQY).
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
Referências
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