ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל
Summary
פרוטוקול זה מציג הליך מלא ומפורט להחלת RNA-seq, טכנולוגיית דור הבא DNA עצמת רצף, לtranscriptomes פרופיל בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה הוא להכליל לתאים או רקמות שונים שנפגעו על ידי חומרים כימיים שונים או במחלות.
Abstract
האפיון של ביטוי גנים בתאים באמצעות מדידת רמות ה-mRNA הוא כלי שימושי בקביעה כמה מכונות התעתיק של התא מושפעות מאותות חיצוניים (לדוגמה: טיפול תרופתי), או כמה תאים שונים בין מצב בריא ומצב חולה. עם כניסתו ועידון מתמיד של טכנולוגיית רצפי DNA של הדור הבא, RNA-רצף (RNA-seq) הפך שיטה פופולרית יותר ויותר של ניתוח transcriptome לקטלג את כל המינים של תמלילים, כדי לקבוע את מבנה התעתיק של כל הגנים הביעו ולכמת הרמות המשתנות הביטוי של המערך הכולל של תמלילים בניתן 1,2 תא, רקמה או אורגניזם. RNA-seq הדרגה מחליף מערכי DNA כשיטה מועדפת לניתוח transcriptome כי יש לו את היתרונות של אפיון transcriptome מלא, ומספק נתון סוג דיגיטלי (מספר העתק של כל פרוטוקול) ולא להסתמך על כל sequen הגנומי ידוע3 לספירה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומפורט כדי להחיל RNA-seq לtranscriptomes פרופיל בתאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה מבוסס על המחקר שפורסם לאחרונה תחת הכותרת שלנו "RNA-seq חושף transcriptome רומן של גנים וisoforms בתאי כלי דם ריאתי אדם שטופלו באנדותל טרומבין," 4 שבבצענו ניתוח transcriptome המלא הראשון של תאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל בהצלחה טופל בתרומבין באמצעות RNA-seq. הוא הניב משאבים חסרי תקדים לניסויים נוספים כדי לקבל תובנה לתוך מנגנונים מולקולריים שבבסיס תפקוד האנדותל תרומבין בתיווך בפתוגנזה של מצבים דלקתיים, סרטן, סוכרת, ומחלת לב כלילית, ומספק לידים חדשים פוטנציאליים למטרות טיפוליות למחלות אלה.
טקסט התיאורים של פרוטוקול זההוא מחולק לארבעה חלקים. החלק הראשון מתאר את הטיפול בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם תרומבין ו-RNA בידוד, איכות ניתוח וכימות. החלק השני מתאר את בניית ספרייה וסדר. החלק השלישי מתאר את ניתוח הנתונים. החלק הרביעי מתאר assay אימות RT-PCR. תוצאות מייצגות של כמה צעדים מרכזיים מוצגות. טיפים או אזהרות שימושיים כדי לשפר את ההצלחה בשלבים עיקריים מובאים בסעיף הדיון. למרות שפרוטוקול זה משתמש בתאי אנדותל כלי דם ריאתי אדם שטופלו בתרומבין, זה יכול להיות כללי לtranscriptomes הפרופיל בשני תאי יונקים ושאינם יונקים וברקמות שטופלו בגירויים שונים או מעכבים, או להשוואת transcriptomes בתאים או רקמות בין מצב בריא ומצב של מחלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים עיקריים
טיפול RNA: RNases לבזות אפילו את רוב RNA באיכות גבוהה, ולכן יש להקפיד בעת הבידוד, האחסון והשימוש של רנ"א 10. כפפות תמיד שחוקות על מנת למנוע זיהום על ידי RNases שנמצא על ידי אדם. כפפות צריכות להיות שונות לעתים קרו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר סטיבן Kingsmore ומרכז לרפואת הגנום ילדים בבתי החולים ומרפאות מרסי לילדים לשימוש באשכולות המחשוב שלהם לניתוח הנתונים שלנו, צוות של Illumina תחום השירות (אליזבת בוייר, סקוט קוק ומארק קוק) והטכני צוות יועצים לתגובות המהירות שלהם והצעות מועילות על הריצה של מכשיר הדור הבא של רצפי DNA, HiScanSQ, וניתוח איכות נתונים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט HL080042 (לSQY) והקרן הזנק והנחלה של בתי החולים ומרפאות מרסי לילדים, אוניברסיטת מיזורי בקנזס סיטי (לSQY).
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
Referências
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
