الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF
Summary
يتم وصف الخطوات الضرورية لضبط اليومية والاستفادة المثلى من أداء عداد الكريات الشامل CyTOF. وتناقش التعليقات على إعداد العينات ومعدل التدفق الأمثل
Abstract
في السنوات الأخيرة، وتحليل السريع للخلايا واحدة وعادة أجريت باستخدام التدفق الخلوي والأجسام المضادة التي تحمل علامات fluorescently. ومع ذلك فقد حد مسألة التداخل الطيفي للانبعاثات fluorophore عدد من التحقيقات في وقت واحد. في المقابل، فإن كتلة CyTOF جديدة عداد الكريات من قبل الأزواج العلوم DVS السائل نظام إدخال وحيدة الخلية إلى 1 ICP-MS. وبدلا من fluorophores، تقترن البوليمرات التي تحتوي على نظائر المعادن مخلبية عالي التخصيب إلى الأجسام المضادة أو تحقيقات أخرى محددة. 2-5 بسبب نقاء المعدن والقرار الجماعي للعداد الكريات الشامل، وليس هناك "تداخل الأطياف" من النظائر المجاورة، وبالتالي لا حاجة للمصفوفات التعويض. بالإضافة إلى ذلك، ونظرا لاستخدام المعادن اللانثينيدات، وليس هناك خلفية البيولوجية وبالتالي لا يعادل تألق ذاتي. مع نافذة تمتد الشامل الكتلة الذرية 103-203، نظريا يمكن تمييز ما يصل الى 100 في وقت واحد التسميات. حاليا، أكثر من 35 قنوات متاحة باستخدام الكواشف مخلبية المتاحة من العلوم DVS، مما يسمح للتشريح لم يسبق لها مثيل من الملف المناعية من العينات. 6-7
عيوب لكتلة الخلوي تتضمن شرط صارمة لنظائر المعادن منفصلة في التحقيق (لا يعادل مبعثر إلى الأمام أو الجانب)، وحقيقة أنها هي تقنية المدمرة (أي إمكانية لاستعادة الفرز). التكوين الحالي للعداد الكريات الشامل لديها أيضا معدل نقل خلية من خلايا فقط ~ 25٪، مما يتطلب إدخال عدد أكبر من الخلايا.
الأداء اليومي الأمثل للعداد الكريات الشامل يتطلب العديد من الخطوات. الهدف الأساسي من التحسين هو تعظيم قوة إشارة المقاسة من نظائر المعادن المطلوب (M) مع التقليل من تشكيل أكاسيد (M +16) التي من شأنها أن تقلل من شدة إشارة M وتتداخل مع أي إشارة المرجوة في M +16. الخطوة الأولى هي عملية الاحماء الجهاز بحيث ساخنة، وأنا مستقرةوقد أنشئت CP البلازما. الثانية، يجب أن يكون الأمثل للإعدادات الحالية والمكياج معدل تدفق الغاز على أساس يومي. خلال جمع العينات، ويقتصر هذا الحدث من قبل خلية الحد الأقصى لمعدل الكفاءة للكشف عن وسرعة المعالجة إلى 1000 خلية / ثانية. ومع ذلك، وهذا يتوقف على نوعية العينة، حدث تباطؤ معدل الخلية (300-500 خلية / ثانية) وعادة ما يكون من المرغوب فيه السماح أفضل قرار بين الأحداث الخلايا، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من singlets سليمة أكثر من الحلل والحطام. وأخيرا، وتنظيف كافية للآلة في نهاية اليوم يساعد على التقليل من إشارة الخلفية بسبب معدنية مجانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على مدى العقود القليلة الماضية، كان التدفق الخلوي مضان طريقة العمود الفقري لتحليل الخلايا واحدة، سواء من حيث التعبير والسطح في المقايسات الفنية. ومع ذلك فقد حد لقضايا التداخل الطيفي لصبغات الفلورسنت عدد علامات في وقت واحد. في حين تم الإبلاغ عن التجارب باستخدام أكثر …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور ايفان والدكتور نيويل Bendall شون للوقوف على آرائهم. نود أيضا أن نشكر DVS العلوم والدكتور شون Bendall لعينة من الخرز البوليسترين موضوع متعدد اللانثينيدات التي تحتوي على. ونحن ممتنون للتمويل من المنحة NIH 2 U19 AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referências
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
