Mass Cytometry: Protokol for Daily Tuning og Running celleprøver på en CyTOF Mass Cytometer
Summary
De nødvendige skridt til daglig tuning og optimering af udførelsen af en CyTOF masse cytometer er beskrevet. Kommentarer til optimal prøveforberedelse og strømningshastighed diskuteres
Abstract
I de senere år har den hurtige analyse af enkelte celler, der normalt blevet udført under anvendelse af flowcytometri og fluorescens-mærkede antistoffer. Imidlertid har spørgsmålet om spektral overlapning af fluorofor-emission begrænset antallet af samtidige prober. I modsætning hertil, den nye CyTOF masse cytometer af DVS Sciences par en flydende encellede introduktion system til et ICP-MS. En stedet for fluoroforer er chelaterende polymerer indeholdende højt-beriget metal isotoper koblet til antistoffer eller andre specifikke prober. 2-5 På grund af metal renhed og masse opløsning af massen cytometeret, er der ingen "spektral overlapning" fra tilstødende isotoper, og derfor ikke behov for kompensation matricer. Desuden, på grund af anvendelsen af lanthanidmetaller, der er ingen biologisk baggrund og derfor ikke ækvivalent autofluorescens. Med en masse vindue spænder atommasse 103-203, teoretisk op til 100 etiketter kunne skelnes samtidigt. For øjeblikket, Mere end 35 kanaler er tilgængelige ved hjælp af chelaterende reagenser fås fra DVS Sciences, giver en hidtil uset dissektion af den immunologiske profil af prøver. 6-7
Ulemper masse cytometri omfatter strenge krav om et særskilt metal isotop pr probe (ikke svarer til fremad eller sidespredning), og at det er en destruktiv teknik (ingen mulighed for sortering recovery). Den aktuelle konfiguration af massen cytometer har også en celle transmission på kun ~ 25%, og det kræver et højere input antal celler.
Optimal daglig ydeevne masse cytometeret kræver flere trin. Det grundlæggende mål for optimering er at maksimere det målte signal intensiteten af det ønskede metal-isotoper (M) og samtidig minimere dannelsen af oxider (M +16), som vil reducere M signalintensitet og forstyrre enhver ønsket signal på M 16. Det første trin er at varme op maskinen, så en varm, stabilt ICP plasma er blevet etableret. For det andet skal indstillingerne for nuværende og make-up gasstrømningshastighed optimeres på daglig basis. Under prøveindsamling, er den maksimale celle begivenhed hastighedsbegrænset af detektor effektivitet og forarbejdning hastighed til 1000 celler / sekund. Men afhængigt af prøvens kvalitet, en langsommere celle hændelsesrate (300-500 celler / sekund) er sædvanligvis ønskeligt at gøre det muligt bedre opløsning mellem celler begivenheder og således maksimere intakte singletter løbet dubletter og nedbrudt materiale. Endelig passende rensning af maskinen ved slutningen af dagen til at minimere baggrundssignal som følge af frit metal.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de sidste årtier er fluorescens-flow-cytometri er en arbejdshest fremgangsmåde til analyse af enkelte celler, både med hensyn til overfladeekspression og i funktionelle assays. Imidlertid har spørgsmål vedrørende spektral overlapning af de fluorescerende farvestoffer begrænset antallet af samtidige markører. Mens forsøg med mere end 12 samtidige markører er blevet rapporteret, at kompensationsbeløbet nødvendig gør dette teknisk vanskeligt.
I stedet for fluoroforer, masse-cytom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Evan Newell og Dr. Sean Bendall for feedback. Vi vil også gerne takke DVS Sciences og Dr. Sean Bendall for et udsnit af de Multi-lanthanid-holdige polystyrenperler. Vi er taknemmelige for støtte fra NIH tilskud 2 U19 AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referências
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
