Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer
Summary
De stappen die dagelijks tuning en optimalisatie van de prestaties van een CyTOF massa cytometer beschreven. Reacties op optimale monstervoorbereiding en debiet worden besproken
Abstract
De laatste jaren heeft een snelle analyse van afzonderlijke cellen die zijn uitgevoerd met behulp van flowcytometrie en fluorescent-gemerkte antilichamen. Echter, het probleem van de spectrale overlap van fluorofoor-uitstoot beperkt het aantal gelijktijdige sondes. In tegenstelling tot de nieuwe CyTOF massa cytometer door DVS Sciences paren een vloeistof eencellige invoersysteem een ICP-MS. Een plaats fluoroforen zijn chelaatvormende polymeren die hoogverrijkt metaalisotopen gekoppeld aan antilichamen of andere specifieke probes. 2-5 Door de metalen zuiverheid en massa resolutie van de massa cytometer, er is geen "spectrale overlap" van naburige isotopen, en daarom geen noodzaak voor compensatie matrices. Bovendien, door het gebruik van lanthanide metalen er geen biologische achtergrond en dus geen equivalent van autofluorescentie. Met een massa venster verspreid over atoommassa 103 tot 203, in theorie tot 100 etiketten kunnen tegelijkertijd worden onderscheiden. Tegenwoordig, Meer dan 35 kanalen beschikbaar via de chelerende reagentia die beschikbaar zijn vanaf DVS Sciences, die een ongekend dissectie van de immunologische profiel van monsters. Zes-zeven
Nadelen massa cytometrie onder de strenge eis van een afzonderlijke metalen isotoop per probe (geen equivalent van voorwaartse of zijwaartse verstrooiing), en het feit dat het een destructieve techniek (geen mogelijkheid sorteren recovery). De huidige configuratie van de massa cytometer heeft ook een cel overdrachtssnelheid van slechts ~ 25%, waardoor het noodzakelijk wordt een hogere input aantal cellen.
Optimale dagelijkse prestaties van de massa cytometer vereist een aantal stappen. Het hoofddoel van de optimalisatie is aan de gemeten signaalsterkte van het gewenste metaal isotopen (M) te maximaliseren, terwijl het minimaliseren van de vorming van oxyden (M +16) die de M signaalintensiteit verlagen en interfereren met elke gewenste signaal M +16. De eerste stap is om op te warmen de machine, zodat een warme, stabiele ICP plasma is vastgesteld. Ten tweede moet de voor huidige en make-up gasstroom worden geoptimaliseerd op een dagelijkse basis. Tijdens het verzamelen, wordt het maximale cell incidentie beperkt door detector efficiency en verwerkingssnelheid tot 1000 cellen / seconde. Afhankelijk van het monster kwaliteit, een lagere cel incidentie (300-500 cellen / seconde) is gewoonlijk wenselijk om een betere resolutie tussen cellen gebeurtenissen en dus intact singlets maximaliseren over wambuizen en vuil. Tenslotte adequate reiniging van de machine aan het eind van de dag minimaliseert achtergrondsignaal door vrij metaal.
Protocol
Representative Results
Discussion
De laatste decennia is fluorescentie flow cytometrie is een werkpaard methode voor het analyseren enkelvoudige cellen, zowel oppervlakte-expressie en functionele bepalingen. Echter de problemen van spectrale overlap van de fluorescente kleurstoffen beperkt het aantal gelijktijdige markers. Terwijl experimenten met meer dan 12 gelijktijdige markers zijn gemeld, het bedrag van de schadevergoeding die nodig maakt dit technisch moeilijk.
In plaats van fluoroforen, massa cytometrie ontwikkeld doo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Dr Evan Newell en Dr Sean Bendall bedanken voor feedback. We willen ook graag DVS Sciences en Dr Sean Bendall bedanken voor een monster van het Multi-lanthanide-bevattende polystyreen parels. We zijn dankbaar voor de financiering van NIH subsidie 2 U19 AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referências
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
