Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF
Summary
Les mesures nécessaires pour la syntonisation par jour et d'optimisation de la performance d'un cytomètre de masse CyTOF sont décrits. Commentaires sur la préparation optimale de l'échantillon et le débit sont discutés
Abstract
Ces dernières années, l'analyse rapide de cellules individuelles a souvent été réalisée en utilisant la cytométrie en flux et des anticorps à marquage fluorescent. Toutefois, la question du chevauchement spectral d'émission des fluorophores a limité le nombre de sondes simultanées. En revanche, le cytomètre de masse nouvelle CyTOF par des couples Sciences DVS un système d'introduction de liquide à cellule unique à un ICP-MS. 1 Plutôt que de fluorophores, les polymères chélateurs métalliques contenant des isotopes hautement enrichi sont couplés à des anticorps ou d'autres sondes spécifiques 2-5. En raison de la pureté du métal et de la résolution en masse du cytomètre de masse, il n'existe pas de "chevauchement spectral" des isotopes voisins, et donc pas de nécessité pour les matrices de compensation. De plus, en raison de l'utilisation de métaux lanthanides, il n'y a pas d'arrière-plan biologique et donc pas d'équivalent de l'autofluorescence. Avec une fenêtre de masse couvrant masse atomique 103-203, théoriquement jusqu'à 100 étiquettes peuvent être distingués en même temps. Actuellement, Plus de 35 chaînes sont disponibles en utilisant les réactifs chélateur disponible à partir Sciences DVS, ce qui permet une dissection sans précédent du profil immunologique des échantillons. 6-7
Inconvénients de la cytométrie de masse comprennent l'exigence stricte d'un isotope métallique séparé par la sonde (pas d'équivalent de la diffusion vers l'avant ou sur le côté), et le fait qu'il s'agit d'une technique destructrice (pas de possibilité de tri de récupération). La configuration actuelle du cytomètre de masse a également un taux de transmission de cellules de seulement ~ 25%, ce qui nécessite un nombre élevé de cellules d'entrée.
Optimal performance quotidienne de l'cytomètre de masse nécessite plusieurs étapes. L'objectif de base de l'optimisation est de maximiser l'intensité du signal mesuré des isotopes métalliques désirés (M), tout en minimisant la formation d'oxydes (+16 M) qui va diminuer l'intensité du signal M et interférer avec un signal désiré à M +16. La première étape consiste à chauffer la machine pour un climat chaud et stable, jeCP plasma a été mis en place. Deuxièmement, les paramètres de débit de gaz actuelle et le maquillage doit être optimisée sur une base quotidienne. Lors de la collecte de l'échantillon, le taux cellulaire maximale événement est limitée par l'efficacité du détecteur et de la vitesse de traitement de 1000 cellules / seconde. Toutefois, en fonction de la qualité de l'échantillon, un taux plus lent cellule événement (300-500 cellules / seconde) est généralement souhaitable de permettre une meilleure résolution entre les événements cellules et donc de maximiser maillots intactes au cours des doublets et des débris. Enfin, un nettoyage adéquat de la machine à la fin de la journée contribue à réduire le signal de fond en raison de métal libre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour les dernières décennies, la cytométrie en flux par fluorescence a été une méthode bourreau de travail pour l'analyse de cellules uniques, à la fois en termes d'expression de surface et dans des tests fonctionnels. Cependant, les problèmes de chevauchement spectrales des colorants fluorescents a limité le nombre de marqueurs simultanées. Bien que les expériences qui utilisent plus de 12 marqueurs simultanées ont été signalés, le montant de la compensation nécessaire en fait techniquement diff…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Evan Newell et le Dr Sean Bendall des commentaires. Nous tenons également à remercier Sciences DEP et le Dr Sean Bendall pour un échantillon de billes de polystyrène multi-lanthanide contenant. Nous sommes reconnaissants pour le financement du NIH subvention de 2 U19 AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referências
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
