Massa Citometria: Protocollo per l'ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF
Summary
I passi necessari per la sintonizzazione quotidiana e ottimizzazione delle prestazioni di un citometro massa CyTOF sono descritti. Commenti sulla preparazione del campione ottimale e portata sono discussi
Abstract
Negli ultimi anni, l'analisi rapida di singole cellule è comunemente eseguita utilizzando citometria di flusso e anticorpi marcati in fluorescenza. Tuttavia, la questione della sovrapposizione spettrale delle emissioni di fluorofori ha limitato il numero di sonde simultanee. In contrasto, la nuova massa citometro CyTOF da DVS coppie Scienze un liquido a cella singola introduzione di un sistema ICP-MS. 1 Invece di fluorofori, polimeri chelanti contenenti isotopi metallici altamente arricchito sono accoppiati ad anticorpi o altre sonde specifiche. 2-5 A causa della purezza del metallo e la risoluzione di massa del citometro massa, non vi è alcuna "sovrapposizione spettrale" di isotopi vicini, e quindi senza necessità di matrici di compensazione. Inoltre, grazie all'utilizzo di metalli lantanidi, non c'è sfondo biologico e quindi non equivalente di autofluorescenza. Con una finestra massa estende massa atomica 103-203, teoricamente fino a 100 etichette possono essere distinti contemporaneamente. Attualmente, Più di 35 canali sono disponibili utilizzando i reagenti chelante disponibile da DVS Sciences, che consente la dissezione senza precedenti del profilo immunologico dei campioni. 6-7
Svantaggi citometria massa includono il requisito rigido per un isotopo metallico separato per sonda (non equivalente di dispersione in avanti o laterale), e il fatto che si tratta di una tecnica distruttiva (senza possibilità di recupero cernita). L'attuale configurazione del citometro massa ha anche una velocità di trasmissione di cella solo ~ 25%, richiedendo così un numero di ingresso maggiore di cellule.
Ottima performance giornaliera del citometro massa richiede diversi passaggi. L'obiettivo fondamentale della ottimizzazione è quello di massimizzare l'intensità di segnale misurata degli isotopi metallici desiderati (M), riducendo al minimo la formazione di ossidi (M 16) che diminuisce l'intensità del segnale e M interferire con qualsiasi segnale desiderato a M 16. Il primo passo è di riscaldare la macchina in un caldo, stabile ICP plasma è stato stabilito. In secondo luogo, le impostazioni per la frequenza del gas corrente e il make-up di flusso deve essere ottimizzata su base giornaliera. Durante il prelievo, il massimo tasso di eventi cella è limitato dal rilevatore efficienza e velocità di elaborazione a 1000 cellule / secondo. Tuttavia, a seconda della qualità di esempio, un più lento tasso di eventi cella (300-500 cellule / secondo) è generalmente auspicabile consentire una migliore risoluzione tra eventi cellule e quindi massimizzare singlets intatte nel doppietti e detriti. Infine, adeguata pulizia della macchina alla fine della giornata aiuta a minimizzare il segnale di fondo per metallo libero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per questi ultimi decenni, la citometria a flusso di fluorescenza è stato un metodo cavallo di lavoro per analizzare cellule singole, sia in termini di espressione di superficie e in saggi funzionali. Tuttavia, i problemi di sovrapposizione spettrale dei coloranti fluorescenti ha limitato il numero di marcatori simultanei. Mentre gli esperimenti che utilizzano più di 12 marcatori simultanei sono stati riportati, l'importo della compensazione necessaria rende tecnicamente difficile.
Inv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dott. Evan Newell e il Dr. Sean Bendall per il feedback. Vorremmo anche ringraziare DVS Sciences e il Dr. Sean Bendall per un campione delle Multi-lantanidi contenenti perline di polistirene. Siamo grati per il finanziamento dal NIH Grant 2 U19 AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referências
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
