ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル
Summary
CyTOFマスメーターの性能の毎日のチューニングと最適化のために必要な手順が記載されている。最適な試料調製および流量に対するコメントは、説明されてい
Abstract
近年では、単一細胞の迅速な分析は、一般的にフローサイトメトリーや蛍光標識された抗体を用いて実施されています。しかしながら、フルオロフォアの排出量スペクトルの重複の問題は同時プローブの数を制限している。これとは対照的に、むしろ蛍光団より、ICP-MS。1〜液体単一セル導入システムDVS科学夫婦による新しいCyTOF質量サイトメーターは、高濃縮金属同位体を含むキレートポリマーは、抗体または他の特異的なプローブに結合されている。2-5なぜなら金属純度と質量メーターの質量分解能により、隣接する同位体からの "スペクトルの重なり"はありませんので、補償行列は不要。さらに、ランタニド金属を使用しているため、生物学的な背景のため、自家蛍光の等価なものはありません。マスウィンドウで理論的には最大100個のラベルにまたがる原子量103から203は、同時に識別することができた。現在、35以上のチャンネルがサンプルの免疫学的プロファイルの前例のない解剖を可能にする、DVS科学から入手可能なキレート試薬を使用して利用できます。6月7日
マスメトリーの欠点は、プローブごとに別々の金属の同位体（前方または側方散乱のない同等品）、それは破壊的技術（リカバリを並べ替えの可能性なし）であるという事実のために厳格な要件があります。大容量メーターの現在の構成は、このように細胞のより高い入力番号を必要とするだけのセル伝送レート〜25％を持っています。
大容量メーターの最適な毎日の性能はいくつかの手順が必要です。最適化の基本的な目標は、M信号強度を低下させるとM 16で任意の所望の信号と干渉する酸化物（M 16）の形成を最小限に抑えながら、所望の金属の同位元素（M）の測定された信号強度を最大にすることである。最初のステップは、マシンはとても暑い、安定した私を暖めるためにあるCPはプラズマが確立されています。第二に、現在の、メイクアップガス流量の設定は、日常的に最適化する必要があります。サンプル採取時には、最大セルイベント発生率は、1000セル/秒に検出器の効率や処理速度によって制限されます。しかし、サンプルの品質に応じて、遅い細胞イベント発生率は（300〜500セル/秒）は、通常、セルのイベントとの間にこのように良い分解能はダブレットと破片の上に無傷のシングレットを最大化できるようにすることが望ましい。最後に、一日の終わりに、マシンの適切な洗浄は遊離金属に起因するバックグラウンドシグナルを最小限に抑えることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去数十年では、蛍光フローサイトメトリーは、表面発現の観点および機能アッセイの両方において、単一細胞を解析するための馬車馬方法であった。しかし、蛍光色素のスペクトルの重複の問題が同時マーカーの数を制限している。 12以上の同時マーカーを用いた実験が報告されているが、必要な補償金の額は、これは技術的に困難になります。
代わりにフルオロフ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、フィードバックのために博士エヴァン·ニューウェル博士とショーンBendallに感謝したいと思います。我々はまた、マルチランタニド含有のポリスチレンビーズのサンプルについては、DVS科学と博士はショーンBendallに感謝したいと思います。我々は、NIHの助成金2 U19 AI057229からの資金のために感謝しています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referências
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
