Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF
Summary
Las medidas necesarias para la sintonización diaria y la optimización del rendimiento de un citómetro de masa CyTOF se describen. Comentarios sobre la preparación de la muestra y el caudal óptimo se discuten
Abstract
En los últimos años, el rápido análisis de células individuales que comúnmente se ha realizado usando citometría de flujo y anticuerpos marcadas con fluorescencia. Sin embargo, la cuestión de la superposición espectral de emisión de fluoróforo ha limitado el número de sondas simultáneamente. En contraste, el nuevo citómetro CyTOF masa por DVS pareja Ciencias un líquido único sistema de células de introducción a una ICP-MS. 1 En lugar de fluoróforos, polímeros quelantes que contienen altamente enriquecido isótopos metálicos están acopladas a anticuerpos u otras sondas específicas. 2-5 Debido a la pureza del metal y resolución de masa del citómetro de masa, no hay "superposición espectral" de isótopos vecinos, y por lo tanto no hay necesidad de matrices de compensación. Además, debido a la utilización de metales lantánidos, no hay fondo biológica y por lo tanto no equivalente de la autofluorescencia. Con una ventana de masa que abarca masa atómica 103-203, teóricamente hasta 100 etiquetas se podía distinguir simultáneamente. Actualmente, Más de 35 canales disponibles utilizando los reactivos quelantes disponible en Ciencias de la DVS, lo que permite una disección sin precedentes del perfil inmunológico de las muestras. 6-7
Las desventajas de la citometría de masa incluyen el requisito estricto de un isótopo de metal separado por sonda (no equivalente de dispersión frontal o lateral), y el hecho de que es una técnica destructiva (sin posibilidad de ordenar la recuperación). La configuración actual del citómetro de masa también tiene una velocidad de transmisión de células de sólo ~ 25%, por lo que requieren un número de entrada más alta de células.
Óptimo rendimiento diario del citómetro de masas requiere varios pasos. El objetivo básico de la optimización es maximizar la intensidad de señal medida de los isótopos metálicos deseados (M) mientras se minimiza la formación de óxidos (M +16) que disminuirá la intensidad de la señal M e interferir con cualquier señal deseada a M +16. El primer paso es para calentar la máquina para un caliente, estable ICP plasma ha sido establecida. En segundo lugar, los ajustes para la velocidad de flujo de gas actual y el maquillaje debe ser optimizado en una base diaria. Durante la recogida de la muestra, la velocidad de células de evento máxima está limitada por la eficiencia del detector y la velocidad de procesamiento a 1000 células / segundo. Sin embargo, dependiendo de la calidad de la muestra, un tipo de célula caso, más lento (300-500 células / segundo) es por lo general deseable para permitir una mejor resolución entre los eventos de las células y por lo tanto maximizar singletes intactas sobre dobletes y escombros. Por último, la adecuada limpieza de la máquina al final del día ayuda a minimizar la señal de fondo debido a metal libre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para las últimas décadas, la citometría de flujo de fluorescencia ha sido un método caballo de trabajo para el análisis de células individuales, tanto en términos de expresión en la superficie y en ensayos funcionales. Sin embargo, los problemas de la superposición espectral de los colorantes fluorescentes se ha limitado el número de marcadores simultáneas. Mientras que los experimentos que utilizan más de 12 marcadores simultáneos se ha informado, el monto de la compensación necesaria que hace que este t?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias al Dr. Evan Newell y el Dr. Sean Bendall para la retroalimentación. También nos gustaría dar las gracias Ciencias DVS y el Dr. Sean Bendall para una muestra de las perlas de poliestireno múltiples que contienen lantánidos. Estamos muy agradecidos por la financiación de los NIH subvención AI057229 U19 2.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referências
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
