Mass Cytometry: Protokoll för Daily Tuning och kör prover cell på en CyTOF Mass Cytometer
Summary
De åtgärder som krävs för daglig avstämning och optimering av prestanda för en CyTOF massa flödescytometer beskrivs. Kommentarer till optimal provberedning och flöde diskuteras
Abstract
Under senare år har den snabba analysen av enstaka celler vanligen utförts med användning av flödescytometri och fluorescensmärkta antikroppar. Emellertid, har frågan om spektral överlappning av fluorofor utsläpp begränsade antalet samtidiga sönder. I motsats, den nya CyTOF massan cytometer av DVS Sciences kopplar en flytande enkel-cell-introduktion systemet till en ICP-MS. 1 stället fluoroforer är kelatbildande polymerer innehållande högt anrikade metall isotoper kopplade till antikroppar eller andra specifika sönder. 2-5 På grund av metall renhet och massa upplösning av massan cytometern, det finns ingen "spektral överlappning" från närliggande isotoper och därför inget behov av ersättning matriser. Dessutom, på grund av användningen av lantanid metaller, finns det inga biologiska bakgrund och därför ingen ekvivalent autofluorescens. Med en massa fönster spänner atommassa 103-203, teoretiskt upp till 100 etiketter kan urskiljas samtidigt. För närvarande, Mer än 35 kanaler är tillgängliga med hjälp av kelatbildande reagenser tillgängliga från DVS Sciences och möjliggjort en oöverträffad dissektion av det immunologiska profil prover. 6-7
Nackdelar med massa cytometri inkluderar strikta krav på en separat metall isotop per prob (ingen motsvarande framåt eller sidospridning), och det faktum att det är en destruktiv teknik (ingen möjlighet att sortera återvinning). Den nuvarande utformningen av massan cytometern har också en hastighet cell överföring av endast ~ 25%, vilket kräver en högre ingång antal celler.
Optimala dagliga prestanda massan cytometern kräver flera steg. Det grundläggande målet för optimeringen är att maximera den uppmätta signalintensiteten av den önskade metallen isotoper (M) under minimering av bildningen av oxider (M +16) som kommer att minska M signalintensitet och störa någon önskade signalen vid M +16. Det första steget är att värma upp maskinen så en varm, stabil jagCP plasma har fastställts. Andra måste inställningarna för ström och smink gasflödeshastigheten optimeras på en daglig basis. Under provtagning, den maximala cellen händelsen ränta begränsas av detektor effektivitet och processorhastighet till 1000 celler / sekund. Beroende på provet kvalitet, en långsammare cell händelse takt (300-500 celler / sekund) är vanligtvis önskvärt att bättre upplösning mellan celler händelser och därmed maximera intakta undertröjor över dubbletter och skräp. Slutligen bidrar adekvat rengöring av maskinen vid slutet av dagen minimera bakgrunden signal på grund av fri metall.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under de senaste årtiondena har fluorescens flödescytometri varit en arbetshäst metod för att analysera enskilda celler, både i fråga om yta uttryck och i funktionella analyser. Emellertid har frågan om spektral överlappning av de fluorescerande färgämnena begränsat antalet samtidiga markörer. Medan försök med mer än 12 samtidiga markörer har rapporterats, gör ersättningsbeloppet nödvändigt detta tekniskt svårt.
Istället för fluoroforer, banade massa cytometri av DVS S…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Evan Newell och Dr Sean Bendall för feedback. Vi vill också tacka DVS vetenskaper och Dr Sean Bendall för ett urval av de flera lantanid-innehållande polystyrenkulor. Vi är tacksamma för finansiering från NIH bidrag 2 U19 AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referências
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
