יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)
Summary
את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).
Abstract
הגילוי של מסלול RNAi באאוקריוטים והפיתוח הבא של סוכני RNAi, כגון siRNA וshRNA, השיג שיטה רבה עצמה להשתקת גנים מסוימים 1-8 לגנומיקה ותרופות תפקודיות. אתגר גדול המעורבים במחקרים מבוססים RNAi הוא המסירה של סוכני RNAi לתאים ממוקדים. טכניקות מסורתיות שאינן נגיפיות משלוח, כגון electroporation בתפזורת ושיטות transfection כימיים לעתים קרובות חוסר השליטה במרחב הנחוצה על משלוח ולהרשות יעילות transfection עניה 9-12. התקדמות בשיטות transfection כימיות כגון שומני קטיוני, פולימרי קטיוני חלקיקים הביאה ליעילות transfection משופרת מאוד 13. עם זאת, שיטות אלו עדיין לא הצליחו להציע שליטה מרחבית מדויקת במסירה שמאוד יכולים להועיל מיניאטורי טכנולוגיות תפוקה גבוהה, מחקרי תא בודדים וחקירות של אינטראקציות תא סלולרי.
nt "> ההתקדמות טכנולוגית האחרונה במסירת הגן אפשר transfection תפוקה גבוהה של תאי חסיד 14-23, רובם משתמשים electroporation microscale. electroporation microscale מציע שליטה זמנית spatio מדויקת במסירה (עד תאים בודדים) והוכח כדי להשיג יעילות גבוהה, 19 24-26. בנוסף, גישות מבוססות electroporation אינן דורשות תקופה ממושכת של דגירה (בדרך כלל 4 שעות) עם קומפלקסי siRNA וה-DNA לפי צורך בשיטות transfection מבוססות כימיות ולגרום לכניסה ישירה של siRNA וDNA עירום מולקולות לתוך הציטופלסמה התא. כביטוי גני תוצאה יכולות להיות מושגת כבר בשש שעות לאחר transfection 27. המעבדה שלנו הוכיחה את השימוש במערכי microelectrode (MEA) עבור transfection אתר ספציפי בתרביות של תאי יונקי חסיד 17-19 בעבר. בגישה המבוססת MEA, מסירת המטען גנטי מושגת באמצעות electroporati המקומי מייקרו בקנה מידהבתאים. יישום של פולס חשמלי לאלקטרודות נבחרת יוצר שדה חשמלי מקומי שמוביל לelectroporation נוכחיים בתאים באזור של אלקטרודות מגורה. השליטה העצמאית של אלקטרודות מייקרו מספקת שליטת מרחב ובזמן על transfection וגם מאפשרת ניסויים מבוססים transfection מרובים להתבצע על אותה תרבות הגדלת התפוקה וההפחתה הניסיונית השתנות תרבות לתרבות.כאן אנו מתארים התקנה הניסיונית ופרוטוקול transfection הממוקד של תאי הלה חסיד עם siRNA מתויג fluorescently מקושקש רצף באמצעות electroporation. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם עבור transfection של וקטורי פלסמיד. בנוסף, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להרחיב בקלות למגוון רחב של שורות תאי יונקים עם שינויים קלים. זמינות מסחרית של MEAs עם דפוסים אלקטרודה מראש מוגדרים והן מותאמים אישית להפוך לא נגיש טכניקה זומעבדות o רוב המחקר עם ציוד תרבית תאים בסיסי.
Protocol
1. MEA הכנה MEAs לשימוש בניסויי electroporation או יכול להיות מפוברק באמצעות טכניקת photolithography סטנדרטית כפי שתואר לעיל 18 או לרכוש ישירות מספקים של יצרני MEA כגון מערכות מרובות ערוצים (http:/www.multic…
Discussion
במאמר זה וידאו שמדגימים את שימוש MEA לtransfection אתר ספציפי של תאי הלה עם מקושקש רצף של siRNA. אחד היתרונות של טכנולוגיה זו היא תחולתו לשורות תאים שונות, כוללים שורות תאים ראשוניות. המעבדה שלנו הוכיחה בעבר את השימוש בטכנולוגיה זו לtransfection אתר ספציפי של התרבות העצבית ביפוקמפוס…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
Referências
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550 (2002).
- Lee, N. S. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).
- Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).
- Raptis, L. H. applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide. Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).
- Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers. International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411, 107-110 (2001).
- Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes. Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).
- Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer. Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells. Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture. Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).
- Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays. Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).
- Huang, H. An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery. Lab Chip. 11, 163-172 (2010).
- Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Efficient and high-throughput electroporation chips. , (2011).
- Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays. Lab Chip. 12, 939-947 (2012).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).
- Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).
- Boukany, P. E. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).
Citar este artigo
Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415, doi:10.3791/4415 (2012).