Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)
Summary
Der Artikel beschreibt das Protokoll für ortsspezifische Transfektion von verscrambeltem Sequenz von siRNA in einer anhaftenden Säugerzellkultur mit Hilfe eines Mikroelektrodenfeldanordnung (MEA).
Abstract
Die Entdeckung von RNAi in Eukaryoten und der anschließenden Entwicklung von RNAi Mittel wie siRNA und shRNA, haben eine potente Verfahren zum Silencing spezifische Gene 1-8 für funktionelle Genomik und Therapeutika erreicht. Eine große Herausforderung bei RNAi basierenden Studien beteiligt ist die Lieferung von RNAi Agenten gezielt Zellen. Traditionelle non-viralen Techniken, wie Bulk-Elektroporation und chemische Transfektionsmethoden fehlt oft die notwendige räumliche Kontrolle über Lieferung und leisten schlechte Transfektionseffizienz 9-12. Jüngste Fortschritte in der chemischen Transfektionsmethoden wie kationische Lipide, kationische Polymere und Nanopartikel wurden in stark verbesserte Transfektionseffizienzen 13 geführt. Allerdings sind diese Techniken immer noch nicht präzise räumliche Kontrolle über Lieferzeiten, die immens Hochdurchsatz-Technologien, einzelne Zelle Studien und Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen können miniaturisierte Nutzen bieten.
nt "> Neueste technologische Fortschritte in der Gentransfer haben High-Throughput-Transfektion von adhärenten Zellen 14-23, ein Großteil davon mikroskaligen Elektroporation verwenden aktiviert. Microscale Elektroporation bietet präzise räumlich-zeitliche Kontrolle über Lieferung (bis auf einzelne Zellen) und hat sich gezeigt, um hohe Wirkungsgrade 19, 24-26. Zusätzlich zu erreichen, müssen Elektroporation Ansätze erfordern eine längere Inkubationszeit (in der Regel 4 Stunden) mit siRNA und DNA-Komplexe wie nötig in der chemischen Basis Transfektionsmethoden und führen zu direkten Eingabe der nackte siRNA und DNA Moleküle in die Zelle Zytoplasma. Als Folge Genexpression kann bereits sechs Stunden nach der Transfektion 27 erreicht werden. Unser Labor hat zuvor die Verwendung von Mikroelektrodenarrays (MEA) für die ortsspezifische Transfektion in adhärenter Säugerzellkulturen 17-19 gezeigt. In der MEA Ansatz, erfolgt die Lieferung der genetischen Nutzlast über lokale Mikro-Maßstab electroporati erreichtauf der Zellen. Eine Anwendung des elektrischen Impulses an den ausgewählten Elektroden erzeugt lokale elektrische Feld, die Elektroporation von Zellen in der Region der stimulierten Elektroden führt. Die unabhängige Steuerung der Mikroelektroden stellt räumliche und zeitliche Steuerung über Transfektion und ermöglicht auch mehrere Transfektion basierte Experimente auf der gleichen Kultur durchgeführt werden Erhöhung des Durchsatzes und zur Verringerung experimentellen Kultur-zu-Kultur Variabilität.Hier beschreiben wir den Versuchsaufbau und das Protokoll für die gezielte Transfektion von adhärenten HeLa-Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten verschlüsselten Sequenz siRNA mittels Elektroporation. Das gleiche Protokoll kann auch zur Transfektion von Plasmid-Vektoren verwendet werden. Zusätzlich kann das hier beschriebene Protokoll leicht an eine Vielzahl von Säugetier-Zelllinien mit geringfügigen Modifikationen verlängert werden. Kommerzielle Verfügbarkeit von MEAs sowohl mit vordefinierten und benutzerdefinierten Elektrode Muster machen diese Technik zugänglich to die meisten Forschungslabors mit grundlegenden Zellkultur Ausrüstung.
Protocol
Discussion
In diesem Video Artikel zeigen wir die Verwendung von MEA für die ortsspezifische Transfektion von HeLa-Zellen mit verschlüsselten Sequenz von siRNA. Einer der Vorteile dieser Technologie ist die Anwendbarkeit auf verschiedene Zelllinien einschließlich primären Zelllinien. Unser Labor hat zuvor die Verwendung dieser Technologie für die ortsspezifische Transfektion von primären hippocampalen Neuronen Kultur von E18 Tage alten Ratten und NIH-3T3-Zellen mit verwürfelten siRNA Sequenzen und GFP-Plasmid 18, 19</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
Referências
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