Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA)

Resumo

Os detalhes do protocolo de artigo para site-specific transfecção de scrambled sequência de siRNA em uma cultura de células aderentes mamíferos usando uma rede de microeletrodos (MEA).

Resumo

A descoberta da via de RNAi em eucariotos e subsequente desenvolvimento de agentes de RNAi, como siRNA e shRNA, ter alcançado um método poderoso para silenciar genes específicos ^1-8 para genômica funcional e terapêutica. Um dos maiores desafios envolvidos em estudos de RNAi base é a entrega de agentes de RNAi para as células-alvo. As técnicas tradicionais de entrega não virais, tais como a electroporação em massa e métodos de transfecção químicos muitas vezes não têm o necessário controlo espacial sobre a entrega e proporcionar eficiências de transfecção pobres ^9-12. Avanços recentes em métodos químicos, tais como a transfecção lipidos catiónicos, polímeros catiónicos e nanopartículas têm resultado em eficiências de transfecção altamente melhorados ^13. No entanto, estas técnicas ainda não oferecem o controle espacial preciso sobre entrega que pode beneficiar imensamente miniaturizado tecnologias de alta capacidade, estudos de células individuais e investigação de interações célula-célula. nt "> Recentes avanços tecnológicos na entrega de genes permitiram alto rendimento a transfecção de células aderentes ^14-23, a maioria dos quais utilizam electroporação microescala. electroporação microescala oferece controlo espaço-temporal preciso sobre o parto (até as células individuais) e tem sido demonstrado para obter eficiências elevadas ^{19, 24-26.} Além disso, as abordagens baseadas em electroporação não necessitam de um longo período de incubação (normalmente de 4 horas) com siRNA e complexos de ADN, conforme necessário, em métodos químicos à base de transfecção e levar à entrada directa de ADN nu, e siRNA moléculas no citoplasma celular. Como consequência a expressão de genes pode ser alcançada tão cedo quanto seis horas após a transfecção ^27. nosso laboratório tem demonstrado o uso de matrizes de microeletrodos (MEA) de sítio-específica de transfecção em culturas aderentes de células de mamíferos ^17-19. Na abordagem baseada MEA, a entrega de carga genética é conseguido através de micro-escala localizada electroporatina de células. Uma aplicação de impulsos eléctricos para os eléctrodos seleccionados gera campo eléctrico local que conduz a electroporação de células presentes na região dos eléctrodos estimulados. O controlo independente dos micro-eléctrodos proporciona um controlo espacial e temporal sobre a transfecção e também permite que múltiplas experiências de transfecção à base a ser executada com a mesma cultura aumentando o rendimento e reduzindo experimental de cultura para cultura de variabilidade.

Aqui nós descrevemos a montagem experimental e do protocolo para transfecção alvo de células HeLa aderentes com uma seqüência de siRNA fluorescente etiquetado mexidos com eletroporação. O mesmo protocolo pode também ser utilizado para a transfecção de vectores plasmídicos. Além disso, o protocolo aqui descrito pode ser facilmente alargada a uma variedade de linhas de células de mamíferos, com pequenas modificações. Disponibilidade comercial de MEAs com padrões de eletrodos tanto pré-definidos e personalizados fazer esta t técnica acessívela maioria dos laboratórios de pesquisa Ø com equipamento básico de cultura de células.

Protocolo

1. MEA Preparação

1. MEAs para uso em experimentos de eletroporação pode ser fabricado usando a técnica de fotolitografia padrão, como descrito anteriormente ¹⁸ ou comprados diretamente de fornecedores de fabricantes MEA como Sistemas Multi Channel (http:/www.multichannelsystems.com/) e MED Alpha Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . Os MEAs utilizados em nossos experimentos foram fabricados em casa na instalação de sala limpa na Universidade Estadual do Arizona, que é administrado pelo Centro de Pesquisas do Estado Sólido Eletr....

Discussão

Neste artigo de vídeo que demonstram a utilização de MEA por site-specific transfecção de células HeLa com scrambled sequência de siRNA. Uma das vantagens desta tecnologia é a sua aplicabilidade a diferentes linhas de células, incluindo linhas de células primárias. O nosso laboratório tem demonstrado previamente a utilização desta tecnologia para o site-specific transfecção de cultura primária do hipocampo neuronal de rato E18 dia de idade e células NIH-3T3 com sequências de siRNA mexidos e GFP plasmídeo ^{18, 19.}

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Meios celulares: Avançado MEM L-Glutamina 200 mM Penicilina / estreptomicina De soro fetal bovino	Gibco / Invitrogen HIMEDIA Laboratories / VWR Lonza Group Ltd. Gibco / Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Composição celular de mídia: 2% de FBS Pennstrep, 2% de L-glutamina e 2% em Advance MEM
Tripsina EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 e rodamina marcado mexidos sequsiRNA referência	Qiagen, Inc.	1027292
Tampão de electroporação	Biorad Laboratories	165-2677
Forma de onda do gerador	Pragmático	2414A	Qualquer forma de onda / gerador de impulsos que pode fornecer os impulsos desejados podem ser usados.