L'articolo descrive il protocollo per sito-specifica di transfezione criptato sequenza di siRNA in una coltura cellulare di mammifero aderente utilizzando una matrice di microelettrodi (MEA).
La scoperta della via di RNAi in eucarioti e il conseguente sviluppo di agenti RNAi, come siRNA e shRNA, hanno raggiunto un metodo efficace per mettere a tacere i geni specifici 1-8 per la genomica funzionale e terapie. Una sfida importante coinvolto in studi basati su RNAi è la consegna di agenti RNAi alle cellule bersaglio. Tradizionali non virali tecniche di parto, come l'elettroporazione di massa e metodi di trasfezione chimici spesso non hanno il controllo spaziale necessaria su consegna e permettere l'efficienza di trasfezione poveri 9-12. I recenti progressi nei metodi di trasfezione chimici come lipidi cationici, polimeri cationici e nanoparticelle hanno portato ad efficienze di trasfezione altamente avanzate 13. Tuttavia, queste tecniche ancora non riescono a offrire un controllo preciso dello spazio sulla consegna che possono beneficiare immensamente miniaturizzata tecnologie high-throughput, studi cella singola e le indagini di interazioni cellula-cellula.
nt "> I recenti progressi tecnologici nella consegna del gene hanno permesso alta produttività trasfezione di cellule aderenti 14-23, la maggioranza dei quali utilizzano elettroporazione microscala. elettroporazione Microscale offre spazio-temporale preciso controllo di consegna (fino a singole cellule) ed è stato dimostrato per ottenere alte efficienze 19, 24-26. Inoltre, approcci basati elettroporazione non richiedono un lungo periodo di incubazione (tipicamente 4 ore) con complessi siRNA e DNA come necessario in metodi di trasfezione base chimica e causare l'immissione diretta di siRNA nudo e DNA molecole nel citoplasma cellulare. Di conseguenza espressione genica può essere ottenuto fino a sei ore dopo la trasfezione 27. nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato l'utilizzo di matrici di microelettrodi (MEA) per sito-specifica trasfezione aderenti in colture cellulari di mammifero 17-19. Nell'approccio basato MEA, la consegna del carico utile genetica avviene tramite localizzato micro-scala electroporatisu di cellule. Una applicazione di impulsi elettrici agli elettrodi selezionati genera locale campo elettrico che conduce alla elettroporazione di cellule presenti nella regione degli elettrodi stimolati. Il controllo indipendente delle micro-elettrodi fornisce controllo spaziale e temporale sopra trasfezione e permette anche esperimenti di trasfezione multipli basati da eseguire sulla stessa cultura aumentando la produttività e riducendo sperimentale cultura a cultura variabilità.Qui si descrive l'apparato sperimentale e il protocollo per la trasfezione mirata di aderenti cellule HeLa con una fluorescente tag criptato siRNA sequenza usando elettroporazione. Lo stesso protocollo può essere utilizzato anche per la trasfezione di vettori plasmidici. Inoltre, il protocollo qui descritto può essere facilmente estesa ad una varietà di linee cellulari di mammifero con modifiche secondarie. Disponibilità commerciale degli accordi ambientali multilaterali con i modelli di elettrodi sia predefiniti e personalizzati rendono questa t accessibile tecnicala maggior parte dei laboratori di ricerca o con attrezzature di base di coltura cellulare.
In questo articolo il video che dimostrano l'uso di MEA per il sito-specifica trasfezione di cellule HeLa con strapazzate sequenza di siRNA. Uno dei vantaggi di questa tecnologia è la sua applicabilità a diverse linee cellulari incluse linee cellulari primarie. Il nostro laboratorio ha già dimostrato l'uso di questa tecnologia per il sito-specifica trasfezione di colture primarie neuronali dell'ippocampo di ratto E18 dal giorno di vita e NIH-3T3 strapazzate con sequenze siRNA e GFP plasmide 18, 19.</…
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |