Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA)
Summary
Os detalhes do protocolo de artigo para site-specific transfecção de scrambled sequência de siRNA em uma cultura de células aderentes mamíferos usando uma rede de microeletrodos (MEA).
Abstract
A descoberta da via de RNAi em eucariotos e subsequente desenvolvimento de agentes de RNAi, como siRNA e shRNA, ter alcançado um método poderoso para silenciar genes específicos 1-8 para genômica funcional e terapêutica. Um dos maiores desafios envolvidos em estudos de RNAi base é a entrega de agentes de RNAi para as células-alvo. As técnicas tradicionais de entrega não virais, tais como a electroporação em massa e métodos de transfecção químicos muitas vezes não têm o necessário controlo espacial sobre a entrega e proporcionar eficiências de transfecção pobres 9-12. Avanços recentes em métodos químicos, tais como a transfecção lipidos catiónicos, polímeros catiónicos e nanopartículas têm resultado em eficiências de transfecção altamente melhorados 13. No entanto, estas técnicas ainda não oferecem o controle espacial preciso sobre entrega que pode beneficiar imensamente miniaturizado tecnologias de alta capacidade, estudos de células individuais e investigação de interações célula-célula.
nt "> Recentes avanços tecnológicos na entrega de genes permitiram alto rendimento a transfecção de células aderentes 14-23, a maioria dos quais utilizam electroporação microescala. electroporação microescala oferece controlo espaço-temporal preciso sobre o parto (até as células individuais) e tem sido demonstrado para obter eficiências elevadas 19, 24-26. Além disso, as abordagens baseadas em electroporação não necessitam de um longo período de incubação (normalmente de 4 horas) com siRNA e complexos de ADN, conforme necessário, em métodos químicos à base de transfecção e levar à entrada directa de ADN nu, e siRNA moléculas no citoplasma celular. Como consequência a expressão de genes pode ser alcançada tão cedo quanto seis horas após a transfecção 27. nosso laboratório tem demonstrado o uso de matrizes de microeletrodos (MEA) de sítio-específica de transfecção em culturas aderentes de células de mamíferos 17-19. Na abordagem baseada MEA, a entrega de carga genética é conseguido através de micro-escala localizada electroporatina de células. Uma aplicação de impulsos eléctricos para os eléctrodos seleccionados gera campo eléctrico local que conduz a electroporação de células presentes na região dos eléctrodos estimulados. O controlo independente dos micro-eléctrodos proporciona um controlo espacial e temporal sobre a transfecção e também permite que múltiplas experiências de transfecção à base a ser executada com a mesma cultura aumentando o rendimento e reduzindo experimental de cultura para cultura de variabilidade.Aqui nós descrevemos a montagem experimental e do protocolo para transfecção alvo de células HeLa aderentes com uma seqüência de siRNA fluorescente etiquetado mexidos com eletroporação. O mesmo protocolo pode também ser utilizado para a transfecção de vectores plasmídicos. Além disso, o protocolo aqui descrito pode ser facilmente alargada a uma variedade de linhas de células de mamíferos, com pequenas modificações. Disponibilidade comercial de MEAs com padrões de eletrodos tanto pré-definidos e personalizados fazer esta t técnica acessívela maioria dos laboratórios de pesquisa Ø com equipamento básico de cultura de células.
Protocol
Discussion
Neste artigo de vídeo que demonstram a utilização de MEA por site-specific transfecção de células HeLa com scrambled sequência de siRNA. Uma das vantagens desta tecnologia é a sua aplicabilidade a diferentes linhas de células, incluindo linhas de células primárias. O nosso laboratório tem demonstrado previamente a utilização desta tecnologia para o site-specific transfecção de cultura primária do hipocampo neuronal de rato E18 dia de idade e células NIH-3T3 com sequências de siRNA mexidos e GFP plasm?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
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