Mikroelektrod Diziler Kullanarak siRNA Bağlanan Hücre Yüksek verim, Siteye özgü Transfeksiyon (MEA)
Summary
Bir mikroelektrot dizisi (MEA) kullanarak bir yapışkan memeli hücre kültüründe siRNA karıştırılmış dizi site-spesifik transfeksiyon için madde ayrıntılar protokolü.
Abstract
Ökaryotlarda ve böyle siRNA ve shRNA olarak RNAi ajanlar, sonraki gelişimi RNAi yolunun keşfi, fonksiyonel genomik ve tedavi için spesifik genler 1-8 susturmak için güçlü bir yöntem elde ettik. RNAi temelli çalışmalarda görev alan önemli bir sorun hedeflenen hücrelere RNAi ajanların teslimat. Böyle toplu elektroporasyon ve kimyasal transfeksiyon yöntemleri gibi geleneksel olmayan viral dağıtım teknikleri, genellikle teslimi üzerinde gerekli mekansal kontrol eksikliği ve 9-12 kötü transfeksiyon verimliliği göze. Bu tür katyonik lipidler, katyonik polimerler ve nanopartiküller olarak kimyasal transfeksiyon yöntemleri son gelişmeler son derece gelişmiş transfeksiyon verimliliği 13 sonuçlandı. Ancak, bu teknikler hala son derece yüksek verimli teknolojiler, tek hücre çalışmaları ve hücre-hücre etkileşimleri soruşturma minyatürize yararlanabilir teslimat üzerinde kesin mekansal kontrol sunmak için başarısız.
nt "gen teslimat> En son teknolojik gelişmeler. yapışık hücrelere yüksek-throughput transfeksiyon 14-23, mikro elektroporasyon kullandığınız bir çoğunluğu sağlamıştır Microscale elektroporasyon (kadar tek hücrelere) teslimi üzerinde hassas uzay-zamansal kontrol sunuyor ve kanıtlanmıştır Ayrıca yüksek verimlilik 19, 24-26. ulaşmak için, elektroporasyon temelli yaklaşımlar kimyasal bazlı transfeksiyon yöntemleri gerekli siRNA ve DNA kompleksleri ile inkübasyon uzun bir süre (genellikle 4 saat) gerektirir ve çıplak siRNA ve DNA'nın doğrudan giriş yol açmaz hücre sitoplazması içine molekülleri. Bunun bir sonucu olarak gen ekspresyonu transfeksiyondan 27 saat sonra altı gibi erken elde edilebilir. Laboratuarımız önceden yapışık memeli hücre kültürleri 17-19 site-spesifik transfeksiyon için mikroelektrot dizilerin kullanımı (MEA) göstermiştir. MEA temelli yaklaşım, genetik yükü teslim lokalize mikro ölçekli electroporati yoluyla elde edilirhücreleri üzerinde. Seçilen elektrotlar ile elektrik sinyalinin bir uygulama uyarılan elektrot bölgesinde mevcut hücrelerin elektroporasyonu yol açar lokal elektrik alanı oluşturur. Mikro elektrotların bağımsız denetim transfeksiyon üzerinde mekansal ve zamansal kontrolü sağlar ve deneysel verim artırılması ve kültür-to-kültür değişkenliği azaltarak aynı kültürü üzerinde yapılacak birden transfeksiyon tabanlı deneyler sağlar.Burada deneysel kurulum ve elektroporasyon kullanarak bir floresan etiketli karıştırılmış dizisi siRNA ile yapışık HeLa hücrelerinin hedef transfeksiyon için protokol açıklar. Aynı protokol de plazmit vektörlerinin transfeksiyon için de kullanılabilir. Buna ek olarak, burada tarif edilen protokol küçük değişikliklerle kolaylıkla ile memeli hücre çizgileri, çeşitli için genişletilebilir. Önceden tanımlanmış ve özel her iki elektrot desenleri ile ÇÇA'lar Ticari durumu bu teknik erişilebilir t olunTemel hücre kültürü ekipmanları ile o en fazla araştırma laboratuarları.
Protocol
Discussion
Bu video yazıda siRNA karıştırılmış dizisi ile HeLa hücrelerinin siteye özgü transfeksiyon için MEA kullanımını göstermektedir. Bu teknolojinin avantajlarından biri primer hücre hatları da dahil olmak üzere farklı hücre hatları uygulanabilmesidir. Bizim laboratuarında önce E18 gün yaşlı sıçan ve pişmiş siRNA dizileri ve plazmid GFP 18, 19 ile NIH-3T3 hücreleri primer hipokampal nöronal kültür siteye özgü transfeksiyon için bu teknolojinin kullanımını göstermiştir. Bi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
Referências
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550 (2002).
- Lee, N. S. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).
- Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).
- Raptis, L. H. applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide. Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).
- Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers. International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411, 107-110 (2001).
- Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes. Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).
- Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer. Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells. Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture. Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).
- Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays. Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).
- Huang, H. An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery. Lab Chip. 11, 163-172 (2010).
- Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Efficient and high-throughput electroporation chips. , (2011).
- Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays. Lab Chip. 12, 939-947 (2012).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).
- Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).
- Boukany, P. E. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).
