Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Resumo

Os fibroblastos de câncer associados (FAC) facilitar tumor iniciação, crescimento e progressão através de sinalização que promove a proliferação, angiogênese e inflamação. Descrevemos aqui um método para isolar populações puras de fibroblastos normais e cafés de rato fresca e tecidos humanos por selecção de células, utilizando PDGFRα como um marcador de superfície.

Resumo

Associadas câncer fibroblastos (FAC), são o tipo de célula mais proeminente dentro do estroma tumoral de muitos cancros, em particular, carcinoma da mama, e a sua presença é muitas vezes associada proeminente com ^1,2 prognóstico pobre. FAC são uma subpopulação de fibroblastos estromais activadas, muitos dos quais expressam o marcador de miofibroblastos α ^SMA-3. FAC originam a partir de fibroblastos dos tecidos locais, bem como a partir de medula óssea derivadas de células recrutadas para o tumor em desenvolvimento e adoptar um fenótipo CAF, sob a influência do microambiente do tumor ^4. FAC foram mostrados para facilitar a iniciação do tumor, crescimento e a progressão através de sinalização que promove a proliferação de células de tumor, angiogénese e invasão ^5-8. Nós demonstramos que a FAC aumentar o crescimento do tumor através da mediação de tumor promover a inflamação, a partir das primeiras fases de pré-neoplásicas ^9. Apesar das evidências cada vez maior das FAC papel crucial na facilitação do crescimento tumoral,FAC estudam tem sido um desafio em curso, devido à falta de marcadores específicos do CAF ea heterogeneidade vasta destas células, com muitos subtipos co-existentes no microambiente do tumor ^10. Além disso, estudos de fibroblastos in vitro é dificultado pelo facto de o seu perfil de expressão do gene é muitas vezes alterados em cultura de tecido ^11,12. Para resolver este problema e permitir que o perfil de expressão gênica de imparcial fibroblastos de rato fresco e tecidos humanos, foi desenvolvido um método baseado em protocolos anteriores de fluorescência Ativado separação celular (FACS) ^13,14. A nossa abordagem baseia-se na utilização PDGFRα como um marcador de superfície para isolar fibroblastos de rato fresca e tecidos humanos. PDGFRα é abundantemente expresso por ambos os fibroblastos normais e cafs ^9,15. Este método permite o isolamento de populações puras de fibroblastos normais e cafés, incluindo, mas não limitado a α-SMA + activado miofibroblastos. Fibroblastos isolados podem então serutilizados para a caracterização e comparação da evolução da expressão do gene que ocorre no FAC durante a tumorigénese. Na verdade, nós e outros relataram perfil de expressão de fibroblastos isolados pela classificação celular ^16. Este protocolo foi realizado com sucesso em isolar e perfil populações altamente enriquecido de fibroblastos dos tecidos da pele, pâncreas, mama e pulmão. Além disso, o nosso método também permite que a cultura de células seleccionadas, a fim de realizar experiências funcionais e para evitar a contaminação por células tumorais, o que é muitas vezes um grande obstáculo ao tentar FAC cultura.

Protocolo

1. Dissecando tecido mamário ou pele de camundongos

1. Antes de dissecação do tecido a partir de ratinhos desejado, preparar os seguintes materiais e reagentes:

   Suprimentos:

   • Ferramentas de operação (lavado com detergente e, em seguida mergulhados em etanol a 70%).
   • Superfície de isopor para descansar o mouse sobre durante a dissecção.
   • Pinos ou agulhas para manter ratos durante a dissecção.
   • Frasco de vidro com tampa para a digestão, contendo uma barra magnética (autoclavado).
   • Banho de água a 37 ° C, contendo um agitador magnético submersível e água suficiente para submergir o frasco de d....

Resultados

Usando PDGFRα como um marcador para fibroblastos resulta em isolamento de populações altamente enriquecidas de fibroblastos de tecido. O nível de pureza após separação foi de 99%, tal como quantificado por tipo pós-análise (Figura 2A). Calculando a percentagem de contaminação de fibroblastos células não pela expressão relativa de genes específicos de células de controlo (Figura 2B) mostra tipicamente contaminação 0,1-0,6%. Este nível de pureza permite profiling transcriptoma de alta qua.......

Discussão

Embora experiências efectuadas em cultura de tecidos podem ser informativas e sugerem princípios funcionais que podem ser verificadas in vivo, que se sabe que ocorrem grandes mudanças na expressão de genes de células em cultura ^11,12. A fim de evitar uma etapa de cultura de tecido, quando o perfil de expressão de genes em fibroblastos, foi desenvolvido um protocolo que permite o isolamento dos normais, bem como as associadas câncer fibroblastos de rato fresco ou de tecido humano. Este protocolo foi a.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente Empresa Número de catálogo Comentários (opcional)
DMEM	Gibco	41965
PBS	Biological Industries	02-023-1A
Colagenase II	Worthington	LS4176
Colagenase IV	Worthington	LS4188
Desoxirribonuclease	Worthington	LS2007
PharmLyse	BD	555899
70 um filtro celular	SPL	93070
Purificada anti-rato CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
Via sonda (7AAD)	E-Bioscience	00-6993-50
Anti-rato CD140a-PE (PDGFRA)	E-Bioscience	12-1401-81
Anti-mouse FITC F4/80-	Cederlane	CL8940F
DMEM w / o Vermelho de Fenol	Gibco	31053
Colágeno tipo I	BD Biosciences	354236