Isolering av Normal og kreft-assosiert fibroblaster fra Fresh vev ved Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS)

Summary

Kreft assosiert Fibroblaster (kafeer) legge til rette startfasen, vekst og fremgang gjennom signaliserer som fremmer spredning, angiogenese, og betennelser. Her beskriver vi en metode for å isolere rene bestander av vanlige fibroblaster og kafeer fra frisk mus og menneskelig vev ved celle sortering, ved hjelp PDGFRα som en overflate markør.

Abstract

Kreft-tilknyttede fibroblaster (kafeer) er de mest fremtredende celletype i tumor stroma av mange kreftformer, særlig brystkreft, og deres fremtredende tilstedeværelse er ofte forbundet med dårlig prognose ^1,2. Er cafs en aktivert subpopulasjon stromale fibroblaster, hvorav mange uttrykker myofibroblast markør α-SMA ^3. Kafeer stammer fra lokale vev fibroblaster samt fra benmargen-avledet celler rekruttert til å utvikle svulst og vedta en CAF fenotype under påvirkning av svulsten mikromiljøet ^4. Kafeer ble vist til rette startfasen, vekst og fremgang gjennom signaliserer som fremmer tumor celleproliferasjon, angiogenese, og invasjonen ^5-8. Vi viste at kafeer forbedre tumorvekst ved å formidle tumor-fremme betennelse, starter tidligst pre-neoplastiske stadier ^9. Til tross for økende bevis av de viktigste rollen kafeer spille i å tilrettelegge tumorvekst,studerer cafs har vært en pågående utfordringen grunnet mangel på CAF-spesifikke markører og de ​​aller heterogenitet av disse cellene, med mange subtyper sameksisterende i tumor mikromiljøet ^10. Videre studerer fibroblaster in vitro hindret av det faktum at deres genuttrykk profilen er ofte endret i vevskultur ^11,12. Å løse dette problemet og for å tillate objektiv gene expression profilering av fibroblaster fra fersk mus og menneskelig vev, har vi utviklet en metode basert på tidligere protokoller for Fluorescence-Activated Cell Sortering (FACS) ^13,14. Vår tilnærming er avhengig av å benytte PDGFRα som en overflate markør for å isolere fibroblaster fra frisk mus og menneskelig vev. PDGFRα er rikelig uttrykt av både normale fibroblaster og kafeer ^9,15. Denne metoden gjør det mulig isolering av rene bestander av vanlige fibroblaster og kafeer, inkludert, men ikke begrenset til α-SMA + aktivert myofibroblasts. Isolerte fibroblaster kan deretter værebrukt til karakterisering og sammenligning av utviklingen av genuttrykk som oppstår i kafeer under tumorigenesis. Faktisk rapporterte vi og andre uttrykk profilering av fibroblaster isolert av celle sortering ^16. Denne protokollen ble vellykket utført for å isolere og profilere høyanriket bestander av fibroblaster fra huden, mammary, bukspyttkjertel og lunge vev. Videre tillater vår metode også dyrking av sortert celler, for å utføre funksjonelle forsøk og for å unngå forurensning av tumorceller, som ofte er en stor hindring ved forsøk til kultur cafs.

Protocol

1. Dissecting Mammary eller hud vev fra mus Før dissekere ønsket vev fra mus, forberede følgende forsyninger og reagenser: Rekvisita: Kirurgi verktøy (vasket med oppvaskmiddel og deretter dyppet i 70% etanol). Styrofoam overflate du kan hvile musen på under disseksjon. Pinner eller nåler for å holde mus under disseksjon. Glasskrukke med lokk for fordøyelsen, inneholder magnetiske rørestav (autoklaverte). Vannbad ved 37 ° C, s…

Representative Results

Bruke PDGFRα som en markør for fibroblaster resulterer i isolasjon av høyanriket bestander av vev fibroblaster. Nivået av renhet etter sortering var 99%, som kvantifisert ved post-sorter analysen (figur 2A). Beregning av prosenten av kontaminerende ikke-fibroblastceller av den relative ekspresjon av celle-spesifikke kontroll gener (figur 2B) viser vanligvis 0,1 til 0,6% forurensning. Dette nivået av renhet gir høy kvalitet transkriptom profilering av isolerte fibroblaster 9.<…

Discussion

Mens eksperimenter utført i vevskultur kan være informative og foreslå funksjonelle prinsipper som kan verifiseres i vivo, er det kjent at store endringer i genekspresjonen av celler i kultur ^11,12. For å unngå en vev kultur skritt når profilering av genuttrykk i fibroblaster, utviklet vi en protokoll som gjør det mulig isolering av normale, samt kreft-tilknyttede fibroblaster fra fersk mus eller menneskelig vev. Denne protokollen ble vellykket anvendt med hud, bukspyttkjertel og bryst vev fra…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM	Gibco	41965
PBS	Biological Industries	02-023-1A
Collagenase II	Worthington	LS4176
Collagenase IV	Worthington	LS4188
Deoxyribonuclease	Worthington	LS2007
PharmLyse	BD	555899
Cell strainer 70 μm	SPL	93070
Purified anti-mouse CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
Via probe (7AAD)	e-Bioscience	00-6993-50
Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa)	e-Bioscience	12-1401-81
Anti-mouse F4/80- FITC	Cederlane	CL8940F
DMEM w/o Phenol Red	Gibco	31053
Collagen Type I	BD Biosciences	354236