Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)
Summary
Os fibroblastos de câncer associados (FAC) facilitar tumor iniciação, crescimento e progressão através de sinalização que promove a proliferação, angiogênese e inflamação. Descrevemos aqui um método para isolar populações puras de fibroblastos normais e cafés de rato fresca e tecidos humanos por selecção de células, utilizando PDGFRα como um marcador de superfície.
Abstract
Associadas câncer fibroblastos (FAC), são o tipo de célula mais proeminente dentro do estroma tumoral de muitos cancros, em particular, carcinoma da mama, e a sua presença é muitas vezes associada proeminente com 1,2 prognóstico pobre. FAC são uma subpopulação de fibroblastos estromais activadas, muitos dos quais expressam o marcador de miofibroblastos α SMA-3. FAC originam a partir de fibroblastos dos tecidos locais, bem como a partir de medula óssea derivadas de células recrutadas para o tumor em desenvolvimento e adoptar um fenótipo CAF, sob a influência do microambiente do tumor 4. FAC foram mostrados para facilitar a iniciação do tumor, crescimento e a progressão através de sinalização que promove a proliferação de células de tumor, angiogénese e invasão 5-8. Nós demonstramos que a FAC aumentar o crescimento do tumor através da mediação de tumor promover a inflamação, a partir das primeiras fases de pré-neoplásicas 9. Apesar das evidências cada vez maior das FAC papel crucial na facilitação do crescimento tumoral,FAC estudam tem sido um desafio em curso, devido à falta de marcadores específicos do CAF ea heterogeneidade vasta destas células, com muitos subtipos co-existentes no microambiente do tumor 10. Além disso, estudos de fibroblastos in vitro é dificultado pelo facto de o seu perfil de expressão do gene é muitas vezes alterados em cultura de tecido 11,12. Para resolver este problema e permitir que o perfil de expressão gênica de imparcial fibroblastos de rato fresco e tecidos humanos, foi desenvolvido um método baseado em protocolos anteriores de fluorescência Ativado separação celular (FACS) 13,14. A nossa abordagem baseia-se na utilização PDGFRα como um marcador de superfície para isolar fibroblastos de rato fresca e tecidos humanos. PDGFRα é abundantemente expresso por ambos os fibroblastos normais e cafs 9,15. Este método permite o isolamento de populações puras de fibroblastos normais e cafés, incluindo, mas não limitado a α-SMA + activado miofibroblastos. Fibroblastos isolados podem então serutilizados para a caracterização e comparação da evolução da expressão do gene que ocorre no FAC durante a tumorigénese. Na verdade, nós e outros relataram perfil de expressão de fibroblastos isolados pela classificação celular 16. Este protocolo foi realizado com sucesso em isolar e perfil populações altamente enriquecido de fibroblastos dos tecidos da pele, pâncreas, mama e pulmão. Além disso, o nosso método também permite que a cultura de células seleccionadas, a fim de realizar experiências funcionais e para evitar a contaminação por células tumorais, o que é muitas vezes um grande obstáculo ao tentar FAC cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora experiências efectuadas em cultura de tecidos podem ser informativas e sugerem princípios funcionais que podem ser verificadas in vivo, que se sabe que ocorrem grandes mudanças na expressão de genes de células em cultura 11,12. A fim de evitar uma etapa de cultura de tecido, quando o perfil de expressão de genes em fibroblastos, foi desenvolvido um protocolo que permite o isolamento dos normais, bem como as associadas câncer fibroblastos de rato fresco ou de tecido humano. Este protocol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Yitzchak Oschry e Dr. Orit Sagi-Asif por sua ajuda com a classificação FACS. Esta pesquisa foi suportada por concessões para a NE do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob subvenção n ° [276890], a partir da Israel Cancer Association (# 20110078), e da Israel Cancer Research Fund (Investigação Prémio Carreira de Desenvolvimento).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
Referências
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