In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico
Summary
Utilizando luciferase e sistemas de imagem in vivo (IVIS) como um novo meio de identificar objectivos de doença antes de desenvolvimentos clínicos ocorrer. IVIS nos permitiu visualizar em tempo real a invasão de vírus encefalíticas durante vários dias, fornecendo um modelo de doença mais precisa para o estudo futuro. Também permitiu-nos identificar as características potenciais de proteção de antivirais e de vacinas mais rápido do que os modelos animais atualmente utilizados. A capacidade de utilizar animais individuais sobre múltiplos pontos temporais garante condições de polícia reduzidos, custos e morbidade global para os animais utilizados garantir um meio mais humanas e mais científica do estudo da doença.
Abstract
Os avanços modernos em tecnologia de imagem estimular o desenvolvimento eo aperfeiçoamento da forma de pesquisa viral é realizado. Inicialmente proposto por Russel e Burch em 3Rs Hume (substituição, redução, refinamento), a utilização de modelos animais na pesquisa científica está sob constante pressão para identificar novas metodologias para reduzir o uso de animais, melhorando a precisão científica ea velocidade. Um grande desafio para diretores de Hume no entanto, é a forma de garantir os estudos são estatisticamente preciso, reduzindo a morbidade das doenças animais e números totais. Estudos de eficácia de vacinas actualmente requerem um grande número de animais, a fim de ser considerado estatisticamente significativo e muitas vezes resultam em morbidade e mortalidade terminais para a identificação de protecção imunitária. Utilizamos sistemas de imagem in vivo (IVIS) em conjunto com uma enzima bioluminescente pirilampo para controlar progressivamente a invasão do sistema nervoso central (SNC) através de uma ciaphalitic vírus em um modelo murino. Tipicamente, a doença progride de forma relativamente lenta, no entanto a replicação do vírus é rápida, especialmente dentro do sistema nervoso central, e pode levar a um resultado, muitas vezes, fatal. Após a infecção intranasal de murganhos com TC83-Luc, uma estirpe de vírus atenuado da encefalite equina venezuelana modificado para expressão de um gene da luciferase, somos capazes de visualizar a replicação do vírus no cérebro, pelo menos, três dias antes do desenvolvimento de sintomas clínicos de doença. Utilizando invasão do SNC como objectivo o desenvolvimento de doença encefálica chave que são capazes de identificar rapidamente terapêutico e proteção da vacina contra TC83-Luc infecção antes de desenvolver os sintomas clínicos. Com a tecnologia IVIS somos capazes de demonstrar o teste rápido e preciso de drogas e vacinas terapêuticas, reduzindo o número de animais e da morbilidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora este protocolo abrange os aspectos de imagem para análise de vivo, é importante reconhecer o vector bioluminescente como factor-chave para estudos futuros. Nossa utilização de TC83, uma estirpe de vacina atenuada de VEEV, como um vector para a expressão de luciferase assegura que grandes quantidades da enzima estão a ser produzidos, devido à elevada taxa de replicação do vírus no SNC como previamente descritos 1-4. Enquanto a adição de um segundo promotor subgenómico e os…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Instituto de Ciências Translacional UTMB-NIH concessão 1UL1RR029876-01 e Prather Alisha por sua assistência com edição de vídeo para este manuscrito.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
Referências
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
