إعداد خطوط الخليوي لضربة قاضية شرطي في التعبير الجيني وقياس تأثيرات ضربة قاضية على الموت الناتج عن خلية E4orf4
Summary
وقد تم قياس مساهمة إعادة عرض لونين ACF عامل إلى موت الخلايا التي يسببها E4orf4. أن البروتوكول تضمن مجموعة من الحيوانات المستنسخة الخلية التي الدوكسيسيكلين العلاج يدفع الشرطي ضربة قاضية للAcf1 مفارز ACF وSNF2h، واستخدام الفحص دابي لقياس E4orf4 التي يسببها موت الخلايا في خطوط الخلايا محرض.
Abstract
تعطيل وظيفية في التعبير الجيني في خلايا الثدييات أمر بالغ الأهمية لدراسة مساهمة بروتين التي تهم 1،2 مسارات مختلفة. ومع ذلك، هناك حاجة ضربة قاضية المشروطة في التعبير الجيني في الحالات التي لا يمكن تحمله من قبل خلايا التأسيسي ضربة قاضية لفترة طويلة من الزمن 3-5. نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد خطوط الخلايا السماح المشروط ضربة قاضية من مفارز من إعادة عرض لونين ACF عامل. هذه خطوط الخلايا تسهيل تحديد مساهمة ACF لتحريض موت الخلايا من البروتين اتش E4orf4 6. والمستنسخة متواليات ترميز الرناوات دبوس الشعر القصير للمفارز Acf1 وSNF2h من إعادة عرض لونين ACF عامل بجوار المروج الدوكسيسيكلين-محرض في البلازميد التي تحتوي على الجين أيضا لالنيوميسين الجينات المقاومة. وقد تم اختيار استنساخ الخلية مقاومة للالنيوميسين في وجود G418 ومعزولة. وقد حثت على خطوط الخلايا الناتجة منالدوكسيسيكلين العلاج، ومرة واحدة أو Acf1 تم تخفيض مستويات التعبير SNF2h، وتقاس الخلايا مع ترميز البلازميد E4orf4 أو متجه فارغة. لتأكيد الأثر المحدد للبنيات shRNA، تم استعادة مستويات البروتين Acf1 أو SNF2h إلى مستويات WT بواسطة cotransfection مع Acf1 البلازميد أو التعبير عن SNF2h التي صدرت مقاومة للshRNA بواسطة إدخال الطفرات الصامتة. تم تحديد قدرة E4orf4 للحث على موت الخلايا في عينات مختلفة من الفحص دابي، والتي تم قياس تواتر ظهور نواة الأشكال التضاريسية مع أفكارك في عدد السكان الخلية بالنقل 7-9.
ويمكن استخدام بروتوكول الموصوفة هنا لتحديد مساهمة الوظيفية للبروتينات مختلفة لتحريض من قبل الشركاء موت الخلايا البروتين في الحالات التي قد يكون ضربة قاضية التأسيسي الخلية القاتلة.
Protocol
Discussion
ضربة قاضية للتعبير جين معين هو مدخلا مهما لتحقيق مساهمة بروتين لمسارات التنظيمية. منذ ضربة قاضية التأسيسي للتعبير عن الجينات الأساسية يؤثر سلبا على تكاثر الخلايا، قد تتطلب دراستهم إما مقدمة من siRNAs عابرة أو تطبيق أنظمة مستقرة ضربة قاضية الشرطي. جيل من خطوط الخلايا مس…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل (جزئيا) من قبل مؤسسة العلوم إسرائيل (المنحة 399/11)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG) في إطار مشروع التعاون الألماني والإسرائيلي (DIP)، ومعهد للبحوث الأسرة رابابورت في في العلوم الطبية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Referências
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
