Fremstilling af cellelinier til Betinget Knockdown af genekspression og måling af Knockdown Virkninger på E4orf4-induceret celledød
Summary
Bidrag ACF chromatin remodeling faktor til E4orf4-induceret celledød blev målt. Protokollen omfatter selektion af cellekloner, hvor doxycyclin behandling inducerer betinget knockdown af ACF-underenheder Acf1 og SNF2h, og brugen af DAPI assay til måling af E4orf4-induceret celledød i de inducerbare cellelinjer.
Abstract
Funktionel inaktivering af genekspression i pattedyrceller er afgørende for studiet af bidraget af et protein af interesse til forskellige veje 1,2. Imidlertid er betinget knockdown af genekspression kræves i tilfælde, hvor konstitutiv knockdown ikke tolereres af celler i en længere tidsperiode 3-5. Her beskriver vi en protokol til fremstilling af cellelinier muliggør betinget knockdown af underenheder af ACF kromatin remodellering faktor. Disse cellelinier lette bestemmelse af bidraget af ACF til induktion af celledød ved adenovirus E4orf4-proteinet 6. Sekvenser, der koder korte hairpin RNAs for Acf1 og SNF2h subunits af ACF chromatin remodeling faktor, blev klonet ved siden af en doxycyclin-inducerbar promotor i et plasmid også indeholder et gen for neomycinresistensgenet. Neomycin-resistente cellekloner blev selekteret i nærværelse af G418 og isoleret. De resulterende cellelinjer blev induceret veddoxycyclin behandling, og når Acf1 eller SNF2h ekspressionsniveauer blev reduceret, blev cellerne transficeret med et plasmid der koder for E4orf4 eller en tom vektor. For at bekræfte den specifikke effekt af shRNA konstruktioner blev Acf1 eller SNF2h proteinniveauer genoprettet til WT niveauer ved cotransfektion med et plasmid, der udtrykker Acf1 eller SNF2h der blev gjort resistente over for shRNA ved indføring af tavse mutationer. Evnen af E4orf4 at inducere celledød i de forskellige prøver blev bestemt ved en DAPI-assay, ved hvilken hyppigheden af forekomsten af kerner med apoptotiske morfologier i den transficerede cellepopulation blev målt 7-9.
Protokollen beskrevet her, kan anvendes til bestemmelse af den funktionelle bidrag af forskellige proteiner til induktion af celledød ved deres protein partnere i tilfælde, hvor konstitutiv knockdown kan være celle-letal.
Protocol
Discussion
Knockdown af specifik genekspression er en vigtig metode til undersøgelsen af bidraget af et protein til regulatoriske veje. Siden konstitutiv knockdown af ekspression af essentielle gener negativt påvirker celleproliferation, kan deres undersøgelse kræve enten forbigående introduktion af siRNAs eller anvendelse af stabile betingede knockdown-systemer. Generering af stabile cellelinjer med kapacitet til medikament-induceret ekspression af shRNAs beskrevet her, tilvejebringer en fordel i forhold til transiente…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet (delvis) af Israel Science Foundation (Grant 399/11), af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inden for rammerne af Den tysk-israelske Projekt Samarbejde (DIP), og af Rappaport Family Institut for Forskning i Medical Sciences.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Referências
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
