Получение клеточных линий для условных нокдаун экспрессии генов и измерения нокдаун влияние на E4orf4-индуцированной гибелью клеток
Summary
Вклад ремоделирования хроматина ACF фактор E4orf4-индуцированной гибели клеток была измерена. Протокол включает в себя отбор клеточных клонов, в которых доксициклин Лечение вызывает условную нокдаун ACF подразделений Acf1 и SNF2h и использование анализа DAPI для измерения E4orf4-индуцированной гибели клеток в линии индуцибельной клетки.
Abstract
Функциональная инактивация экспрессии генов в клетках млекопитающих имеет решающее значение для изучения вклада белков, представляющих интерес для различных 1,2 путями. Тем не менее, условное нокдаун экспрессии гена требуется в тех случаях, когда учредительные нокдаун не допускается клетками в течение длительного периода времени 3-5. Здесь мы опишем протокол для приготовления клеточных линий, позволяющих условного нокдаун подразделений реконструкции фактора ACF хроматина. Эти клеточные линии облегчения определения вклада ACF к индукции клеточной смерти аденовирус E4orf4 белка 6. Последовательности, кодирующие коротких РНК шпилькой для Acf1 и SNF2h подразделений ремоделирования хроматина фактора ACF были клонированы рядом с доксициклином индуцируемого промотора в плазмиды, содержащие также ген для гена устойчивости к неомицину. Неомицин-устойчивых клеточных клонов были отобраны в присутствии G418 и изолированным. В результате клеточных линий были вызваныдоксициклин лечение, и как только Acf1 или SNF2h уровни экспрессии были снижены, клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей E4orf4 или пустой вектор. Для подтверждения конкретного эффекта конструкций ShRNA, уровни Acf1 или SNF2h белка были восстановлены в WT уровней котрансфекции с плазмиды выражения Acf1 или SNF2h которые были оказаны устойчивы к ShRNA путем введения молчащих мутаций. Способность E4orf4, чтобы вызвать гибель клеток в различных образцах определяли с помощью анализа DAPI, в которых частота появления ядер с апоптоза морфологией в трансфицированных популяции клеток измеряли 7-9.
Протокол, описанный здесь, может быть использована для определения функционального вклада различных белков в индукции клеточной смерти со стороны своих партнеров белка в случаях, когда учредительные нокдауна может быть клетка смертельным.
Protocol
Discussion
Нокдаун конкретных экспрессии генов является важным подходом к изучению вклада белка регуляторные пути. С учредительных нокдаун выражение существенных генов негативно влияет на пролиферацию клеток, их изучение может потребовать либо переходного введение siRNAs или применения стабиль?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана (в части) ИЗРАИЛЬ научного фонда (грант 399/11), в Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках германо-израильских проектов сотрудничества (DIP), и Институтом Раппапорт семьи по исследованиям в области Медицинских Наук.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Referências
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
