Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4
Summary
Contribución del factor de remodelación de la cromatina ACF a la muerte celular inducida por E4orf4 se midió. El protocolo incluye la selección de clones de células en las que el tratamiento con doxiciclina induce desmontables condicional de la ACF subunidades Acf1 y SNF2h, y el uso del ensayo de DAPI para medir E4orf4 inducida por la muerte celular en las líneas celulares inducibles.
Abstract
Inactivación funcional de la expresión génica en células de mamífero es crucial para el estudio de la contribución de una proteína de interés a 1,2 diversas vías. Sin embargo, desmontables condicional de la expresión génica se requiere en los casos cuando desmontables constitutiva no es tolerado por las células durante un largo periodo de tiempo 3-5. Aquí se describe un protocolo para la preparación de líneas celulares que permiten desmontables condicional de subunidades del factor de remodelación de la cromatina ACF. Estas líneas celulares de facilitar la determinación de la contribución de la ACF para la inducción de muerte celular por el adenovirus E4orf4 proteína 6. Las secuencias que codifican los ARN de horquilla corta para las subunidades Acf1 y SNF2h del factor de remodelación de la cromatina ACF se clonaron al lado de un promotor inducible por doxiciclina en un plásmido también contiene un gen para el gen de resistencia a neomicina. Resistentes a la neomicina se seleccionaron clones de células en presencia de G418 y aislado. Las líneas celulares resultantes fueron inducidos porel tratamiento con doxiciclina, y una vez Acf1 o los niveles de expresión reducida SNF2h fueron, las células fueron transfectadas con un plásmido que codifica E4orf4 o un vector vacío. Para confirmar el efecto específico de las construcciones shRNA, los niveles de Acf1 o SNF2h proteínas se restauraron a niveles de tipo silvestre por cotransfección con un plásmido que expresa Acf1 o SNF2h que se volvieron resistentes a la shRNA por introducción de mutaciones silenciosas. La capacidad de E4orf4 para inducir la muerte celular en las diferentes muestras se determinó por un ensayo de DAPI, en los que se midió la frecuencia de aparición de núcleos con morfologías apoptóticas en la población de células transfectadas 7-9.
El protocolo aquí descrito puede ser utilizado para la determinación de la contribución funcional de proteínas diferentes a la inducción de muerte celular por los socios de sus proteínas en los casos en que puede ser desmontables constitutiva celular letal.
Protocol
Discussion
Desmontables de la expresión génica específica es un enfoque importante para la investigación de la contribución de una proteína a las vías de regulación. Desde desmontables constitutivo de expresión de genes esenciales afecta negativamente la proliferación celular, su estudio puede requerir ya sea introducción transitoria de siRNAs o la aplicación de sistemas estables desmontables condicionales. Generación de líneas celulares estables con capacidad de expresión inducida por el fármaco de shRNAs descrito…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado (en parte) por la Israel Science Foundation (Grant 399/11), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en el marco de la cooperación germano-israelí Proyecto (DIP), y por el Instituto de la Familia Rappaport de Investigación en las Ciencias Médicas.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Referências
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