Beredning av cell-linjer för villkorlig Knockdown av genuttryck och Mätning av knockdown Effekter på E4orf4-inducerad celldöd
Summary
Bidrag från ACF kromatin remodeling faktor till E4orf4-inducerad celldöd uppmättes. Protokollet innehåller val av cellkloner som doxycyklin behandling inducerar villkorlig ÖVERVÄLDIGANDE av ACF subenheter Acf1 och SNF2h, och användning av DAPI analys för att mäta E4orf4-inducerad celldöd i ledningarna inducerbara cell.
Abstract
Funktionell inaktivering av genuttryck i däggdjursceller är avgörande för att studera bidraget av ett protein av intresse för olika vägar 1,2. Emellertid är villkorad ÖVERVÄLDIGANDE av genuttryck erfordras i de fall då konstitutiv ÖVERVÄLDIGANDE inte tolereras av celler under en lång tidsperiod 3-5. Här beskriver vi ett protokoll för beredning av cellinjer som möjliggör villkorlig ÖVERVÄLDIGANDE av subenheter av ACF kromatin remodeling faktor. Dessa cellinjer underlättar bestämningen av bidrag ACF till induktion av celldöd genom adenovirus E4orf4 proteinet 6. Sekvenser som kodar för korta hårnål RNA för Acf1 och SNF2h subenheter av ACF kromatin remodeling faktor klonades intill en doxycyklin-inducerbar promotor i en plasmid som också innehåller en gen för neomycinresistensgenen. Neomycin-resistenta cellkloner utvaldes i närvaro av G418 och isolerad. De resulterande cellinjerna inducerades genomdoxycyklin behandling, och en gång Acf1 eller SNF2h uttrycksnivåer reducerades, transfekterades cellerna med en plasmid som kodar E4orf4 eller en tom vektor. För att bekräfta den specifika effekten av shRNA konstruktionerna var Acf1 eller SNF2h proteinnivåer återställas till WT nivåer genom samtransfektion med en plasmid som uttrycker Acf1 eller SNF2h som gjorts resistenta mot shRNA genom införandet av tysta mutationer. Förmågan hos E4orf4 att inducera celldöd i de olika proverna bestämdes genom en DAPI-analys, i vilken frekvensen av uppkomsten av kärnor med apoptotiska morfologier i den transfekterade cellpopulationen mättes 7-9.
Protokollet som beskrivs här kan användas för bestämning av den funktionella bidraget av olika proteiner till induktion av celldöd genom deras proteinprodukter partner i de fall när konstitutiva ÖVERVÄLDIGANDE kan vara cell dödlig.
Protocol
Discussion
ÖVERVÄLDIGANDE av specifika genuttryck är en viktig metod för undersökning av bidraget av ett protein till regulatoriska vägar. Eftersom konstitutiv ÖVERVÄLDIGANDE av uttryck av essentiella gener negativt påverkar celltillväxt, kan deras studie kräva antingen övergående införande av siRNA eller tillämpningen av stabila villkorade knockdown system. Generering av stabila cellinjer med kapacitet för läkemedelsinducerad expression av shRNAs beskrivs här, ger en fördel över transienta transfektioner som i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes (delvis) av Israel Science Foundation (Grant 399/11), av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inom ramen för den tysk-israeliska projektsamarbete (DIP), och av Rappaport Family Institute for Research in Medical Sciences.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Referências
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
