E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması
Summary
E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.
Abstract
Memeli hücrelerinde gen ekspresyonu Fonksiyonel inaktivasyonu çeşitli yollar 1,2 ilgilendiren bir protein katkı çalışma için çok önemlidir. Kurucu zaman devirme 3-5 uzun bir süre için hücreler tarafından iyi tolere edilmez Bununla birlikte, gen ekspresyonunun şartlı devirme durumlarda gerekir. Burada ACF kromatin remodeling faktör altbirimden koşullu knockdown izin hücre hatlarının hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu hücre hatları adenovirüs E4orf4 proteini tarafından 6 hücre ölümü indüksiyonu için ACF katkısının belirlenmesi kolaylaştırmak. ACF kromatin yeniden faktörü ACF1 ve SNF2h alt birimleri için kısa firkete RNA kodlayan diziler aynı zamanda neomisin direnç geni için bir geni içeren bir plazmid içinde bir doksisiklin-indüklenebilir promotör yanında klonlandı. Neomisin dirençli hücre klonları izole edilmiş ve G418 varlığında seçilmiştir. Sonuçta elde edilen hücre hatları ile uyarıldığındadoksisiklin tedavi, ve bir kez ACF1 SNF2h ya da ekspresyon düzeyleri azalmıştır, hücre bir plazmid kodlama E4orf4 veya boş vektör ile transfekte edildi. ShRNA yapıların belirli etkisini teyit etmek için, ACF1 veya SNF2h protein seviyeleri sessiz mutasyon dahil edilmesi ile shRNA karşı dirençli hale getirildi ifade eden bir plasmidin ACF1 veya SNF2h ile kotransfeksiyonu ile WT düzeylerine geri alındı. Çeşitli örneklerde hücre ölümünü teşvik etmek için E4orf4 yeteneği transfekte edilmiş bir hücre popülasyonunda apoptoz morfolojiye sahip çekirdeklerin görünüm frekans 7-9 ölçüldüğü bir DAPI tahlil ile belirlenmiştir.
Yapıcı devirme hücre öldürücü olabilir burada açıklanan protokol durumlarda bunların protein partnerleri tarafından hücre ölümü indüksiyonu için çeşitli proteinlerin işlevsel katkı belirlenmesi için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Belirli gen ekspresyon Nakavt düzenleyici yolaklar bir protein katkısı soruşturma için önemli bir yaklaşımdır. Elzem genlerin ifade bünye knockdown olumsuz hücre çoğalmasını etkiler bu yana, yaptıkları çalışmada geçici siRNA'lar giriş veya sabit koşullu devirme sistemleri uygulama ya gerektirebilir. Burada tarif shRNAs bir ilaca bağlı ifade etme yeteneğine sahip kararlı hücre çizgileri üretimi, bir çok hücre hatları etkili olmayabilir geçici Transfeksiyonlar üzerinde bir avantaj sa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Alman-İsrail İşbirliği Projesi (DIP) çerçevesinde Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından İsrail Bilim Vakfı (Hibe 399/11), tarafından ve Araştırma Rappaport Aile Enstitüsü tarafından (kısmen) desteklenmiştir Tıp Bilimleri.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Referências
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
