Imaging Analyse af Neuron til glia Interaktion i Mikrofluid Kultur Platform (MCP)-baseret Neuronal Axon og glia Co-kultur System

Summary

Denne undersøgelse beskriver procedurerne for at oprette en ny neuronal axon og (astro) glia co-kultur platform. I dette co-kultursystem, bliver manipulation af direkte interaktion mellem en enkelt axon (og enkelt gliacelle) mulig, således mekanistisk analyse af den gensidige neuron til gliale signalering.

Abstract

Korrekt neuron at glia interaktion er kritisk for fysiologiske funktion af centralnervesystemet (CNS). Denne tovejskommunikation er sofistikerede medieret af specifikke signalveje mellem neuron og glia ^1,2. Identifikation og karakterisering af disse signalveje er afgørende for forståelsen af, hvordan neuron til glia interaktion figurer CNS fysiologi. Tidligere har neuron-og glia blandede kulturer været almindeligt anvendt til afprøvning og karakterisering af signalveje mellem neuron-og glia. Hvad vi har lært af disse præparater og andre in vivo værktøjer har dog foreslået, at de gensidige signalering mellem neuron og glia ofte forekom i specifikke rum i neuroner (dvs. axon, dendritceller, eller soma) ^3. Det gør det vigtigt at udvikle en ny kultur, der tillader adskillelse af neuronale rum og specifikt undersøger samspillet mellem glia og neuronale axoner / dendritter. Endvidere er den konventionelle blandede kultursystem ikke individualisere de opløselige faktorer og direkte membran kontaktsignaler mellem neuron-og glia. Det store antal neuroner og gliaceller i den konventionelle co-kultur-systemet mangler opløsningen nødvendigt at observere interaktionen mellem en enkelt axon og en gliacelle.

I denne undersøgelse beskriver vi en hidtil ukendt axon-og glia co-dyrkningssystem med anvendelse af en mikrofluid kultur platform (MCP). I dette co-kultursystem er neuroner og gliaceller dyrket i to separate kamre, der er forbundet gennem flere centrale kanaler. I denne microfluidic kultur platform, kan der kun neuronale processer (især axoner) indtast den glial side gennem de centrale kanaler. I kombination med kraftige fluorescerende protein mærkning, tillader dette system direkte undersøgelse af signalveje mellem axonale / dendritisk og glial interaktioner, sådans axon-transkriptionel regulering i glia, glia-medieret receptor handel i neuronale terminaler, og glia-medierede Axon vækst. Den snævre diameter af kammeret også signifikant forbyder strømmen af ​​neuron-beriget medium ind i glia kammer, lette probning af den direkte membran-protein-interaktion mellem axoner / dendritter og glial overflader.

Protocol

1. Montering af Mikrofluid Kultur Afdeling (MCP) MCP (fig. 1) er åbne kamre konstrueret til rumopdelt kulturer af forskellige typer af celler 4. Det har typisk to rum, der er forbundet gennem de centrale kanaler (3 um i diameter). Montering af MCP med glas-bund retter er nødvendig for at udarbejde kulturer og efterfølgende billedbehandling analyse. Dels coat sterile glas-bund retter med polyornithin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) opløst i natriumtetraborat (Sigma-Aldrich,…

Representative Results

Time-lapse imaging analyse af axon-induceret GLT1 promotoraktivering i astrocytter Den rumopdelt neuron og astrocyt co-kultur system tillader kun de neuronale processer, især de axoner, til selektivt at interagere med astrocytter. Efter den vellykkede etablering af axon-og astrocyt (eller andre glialceller) co-kultur i den samlede MCP, kan forskellige typer af axon-glia vekselvirkninger undersøges såsom, axon-induceret aktivering af astroglial genpromotor aktivering, astrocyt-induceret axon …

Discussion

MCP baserede neuron og astrocytter co-kultur system tillader dissektion af detaljerede neuron til astroglia signalveje ved kun at tillade axonerne passerer de centrale kanaler og interaktion med astrogliale celler. Denne co-kultursystem kan hensigtsmæssigt konfigureres med konventionelle neuron og astrocyt kultur procedurer. Vi beskrev også en praktisk anvendelse af denne co-kultur ved at ansætte en eGFP baseret reporter for at demonstrere axon-afhængig GLT1 promotoraktivering i astrocytter.

<p class="jove_conte…

Materials

Fetal bovine serum	Hyclone	SH30070.03	for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135	for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor	R&D systems	212-GD	Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose	Sigma-Aldrich	11995
70 mm cell strainer	BD Falcon	352350
Sterile glass bottom dish	MatTek Corporation
Microfluidic culture platforms	Xona Microfluidics LLC	SND150
6 wells of the culture plate	Cellstar	657 160
			Neuron culture medium Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin
			Neuron culture medium for plating cell Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin 5% Fetal bovine serum SH30070.03
			Astrocyte culture medium Dulbecco modified eagle medium high glucose 10% Fetal bovine serum F4135 1% Penicillin-streptomysin
			Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.