Analyse en Imagerie du Neuron à l'interaction Glia dans la plate-forme microfluidique Culture (MCP) à base neuronale et Axon Glia co-culture système

Summary

Cette étude décrit les procédures de mise en place d'un axone des neurones et roman (astro) glie plate-forme de co-culture. Dans ce système de co-culture, la manipulation de l'interaction directe entre un axone unique (et unique cellule gliale) devient possible, ce qui permet une analyse mécaniste du neurone mutuelle à la signalisation gliales.

Abstract

Neurone propre à l'interaction glie est essentielle à la fonction physiologique du système nerveux central (SNC). Cette communication bidirectionnelle est subtilement médiée par les voies de signalisation spécifiques entre les neurones et les cellules gliales ^1,2. L'identification et la caractérisation de ces voies de signalisation est essentielle à la compréhension de la façon dont l'interaction neurone glie formes physiologie du système nerveux central. Auparavant, des cultures de neurones et de cellules gliales mixtes ont été largement utilisés pour tester et caractériser les voies de signalisation entre les neurones et les cellules gliales. Ce que nous avons appris de ces préparations et autres outils in vivo, cependant, a suggéré que la signalisation mutuelles entre neurones et cellules gliales sont souvent produits dans des compartiments spécifiques à l'intérieur des neurones (c.-à axones, dendrites, ou soma) ^3. Il est donc important de développer un nouveau système de culture qui permet la séparation des compartiments neuronaux et étudie spécifiquement l'interaction entre les cellules gliales et neuroaxones internes / dendrites. En outre, le système de culture conventionnel mixte n'est pas capable de différencier les facteurs solubles et directs signaux de contact membranaire entre les neurones et les cellules gliales. En outre, la grande quantité de neurones et des cellules gliales dans le classique système de co-culture n'a pas la résolution nécessaire pour observer l'interaction entre un axone unique et une cellule gliale.

Dans cette étude, nous décrivons une nouvelle axone et les cellules gliales du système de co-culture avec l'utilisation d'une plate-forme microfluidique culture (MCP). Dans ce système de co-culture, les neurones et les cellules gliales sont cultivées dans deux chambres séparées qui sont connectées par le biais de plusieurs canaux centraux. Dans cette plate-forme microfluidique la culture, seuls les processus neuronaux (en particulier les axones) peut entrer dans le côté gliale à travers les canaux centraux. En combinaison avec marquage des protéines fluorescentes puissant, ce système permet un examen direct des voies de signalisation entre les interactions axonales / dendritiques et des cellules gliales, une telles axone médiée par la régulation transcriptionnelle dans les cellules gliales, les cellules gliales trafic des récepteurs induite dans les terminaux de neurones, les cellules gliales et médiée par la croissance axonale. Le petit diamètre de la chambre également interdit de manière significative l'écoulement du fluide enrichi en neurone dans la chambre gliale, facilitant palpage de la protéine membranaire directe interaction entre les axones / dendrites et les surfaces gliales.

Protocol

1. Assemblée de la Chambre Culture microfluidique (MCP) MCP (figure 1) sont conçus pour les chambres ouvertes cultures compartimentées de différents types de cellules 4. Il a généralement deux compartiments qui sont reliés par les canaux centraux (3 m de diamètre). Assemblée des MCP avec fond de verre plats est nécessaire pour la préparation de cultures et d'analyse d'images ultérieur. Tout d'abord, manteau stériles à fond de verre plats de polyo…

Representative Results

L'analyse d'imagerie time-lapse de l'activation induite par axone promoteur GLT1 dans les astrocytes Le neurone compartimenté et co-culture d'astrocytes système ne permet que les processus neuronaux, notamment des axones, d'interagir sélectivement avec les astrocytes. Suite à la mise en place réussie de l'axone et des astrocytes (cellules gliales ou d'autres) co-culture dans l'assemblée des MCP, différents types d'interactions axone-cellules gliales pe…

Discussion

Le MCP neurone base et les astrocytes du système de co-culture de neurones permet dissection détaillée de astroglies voies de signalisation en n'autorisant que les axones passent les canaux centraux et interagissant avec les cellules astrocytaires. Ce système de co-culture peut être facilement mis en place avec des neurones classiques et des procédures de culture d'astrocytes. Nous avons également décrit une application pratique de ce système de co-culture en employant un journaliste eGFP base pour dém…

Materials

Fetal bovine serum	Hyclone	SH30070.03	for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135	for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor	R&D systems	212-GD	Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose	Sigma-Aldrich	11995
70 mm cell strainer	BD Falcon	352350
Sterile glass bottom dish	MatTek Corporation
Microfluidic culture platforms	Xona Microfluidics LLC	SND150
6 wells of the culture plate	Cellstar	657 160
			Neuron culture medium Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin
			Neuron culture medium for plating cell Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin 5% Fetal bovine serum SH30070.03
			Astrocyte culture medium Dulbecco modified eagle medium high glucose 10% Fetal bovine serum F4135 1% Penicillin-streptomysin
			Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.