Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System
Summary
Diese Studie beschreibt die Verfahren für die Einrichtung einer neuartigen neuronalen Axon und (astro) Glia Co-Kultur-Plattform. Auf diese Co-Kultur-System wird Manipulation direkte Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Axon (und einzigen Gliazelle) durchführbar ist, so dass mechanistischen Analyse des gegenseitigen Neuron zu glialen Signalisierung.
Abstract
Ordnungsgemäße Neuron zu Glia-Wechselwirkung ist entscheidend für physiologische Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS). Diese bidirektionale Kommunikation wird raffiniert durch spezifische Signalwege zwischen Neuron und Glia 1,2 vermittelt. Identifizierung und Charakterisierung dieser Signalwege ist wesentlich für das Verständnis, wie Neuron zu Glia-Wechselwirkung Formen CNS Physiologie. Zuvor haben Neuron und Glia Mischkulturen weithin zum Testen und Charakterisieren Signalwege zwischen Neuronen und Glia ausgenutzt. Was wir von diesen Präparaten und anderen Werkzeugen in vivo gelernt hat jedoch vorgeschlagen, dass die gegenseitige Signalisierung zwischen Neuronen und Glia häufig in speziellen Kompartimenten innerhalb von Neuronen (dh Axon, Dendrit oder Soma) 3 aufgetreten ist. Daher ist es wichtig, eine neue Kultur System, Trennung der Fächer ermöglicht neuronalen Entwicklung und speziell untersucht die Wechselwirkung zwischen Glia und neuronal Axone / Dendriten. Darüber hinaus ist das herkömmliche System Mischkultur nicht fähig Differenzieren der löslichen Faktoren und direkte Membrankontakt Signalen zwischen Neuronen und Gliazellen. Außerdem fehlt die große Menge von Neuronen und Gliazellen im herkömmlichen Co-Kultursystem die Auflösung notwendig, die Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Axon und einer Gliazelle beobachten.
In dieser Studie beschreiben wir eine neue Axone und Glia Kokultur System mit der Verwendung eines mikrofluidischen Kulturplattform (MCP). Auf diese Co-Kultur-System sind Neuronen und Gliazellen in zwei getrennte Kammern, die durch mehrere zentrale Kanäle angeschlossen sind, kultiviert. In diesem mikrofluidischen Kultur-Plattform, kann nur neuronale Prozesse (insbesondere Axone) die Gliazellen Seite durch den zentralen Kanälen geben. In Kombination mit leistungsfähigen fluoreszierendes Protein Etikettierung, ermöglicht dieses System eine direkte Untersuchung von Signalwegen zwischen axonalen / dendritischen und Glia Interaktionen, eine solches Axon-vermittelten Transkriptionsregulation in Glia, Glia-vermittelte Rezeptor-in neuronalen Terminals und Glia-vermittelten Axon Wachstum. Die schmalen Durchmesser der Kammer ebenfalls signifikant verbietet die Strömung des Neurons angereicherten Mediums in die Kammer gliale, Erleichterung Sondieren des direkten Membran-Protein-Wechselwirkung zwischen Axone / Dendriten und glialen Oberflächen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die MCP basierte Neuron und Astrozyten Co-Kultur-System ermöglicht Dissektion detaillierte Neuron Astroglia Signalwege, indem nur die Axone leiten die zentralen Kanäle und Interaktion mit den Astrozyten. Diese Co-Kultur-System bequem eingerichtet werden mit herkömmlichen Neuron und Astrozyten Kultur Verfahren. Beschrieben wir auch eine praktische Anwendung dieser Co-Kultur-System durch den Einsatz eines eGFP basierte Reporter für den Nachweis Axon-abhängige GLT1 Promotoraktivierung in Astrozyten.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Jeffrey Rothstein für die Bereitstellung von BAC GLT1 eGFP Mäusen und GLT1 Antikörper danken; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243; PI, Rob Jackson) für die Bereitstellung von wertvollen Core Facilities; New Fakultät Rekrutierung Zuschuss (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) in Tufts Neuroscience Department.
Materials
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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Neuron culture medium for plating cell
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Astrocyte culture medium
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Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
Referências
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