マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析
Summary
この研究では、神経細胞の軸索と小説（ASTRO）グリア共培養プラットフォームをセットアップする手順について説明します。この共培養系では、単一の軸索（と単一神経膠細胞）との間の直接的な相互作用の操作は、グリアシグナリング相互ニューロンのメカニズム解析を可能にすることが可能となる。
Abstract
グリア相互作用への適切なニューロンは、中枢神経系（CNS）の生理機能に重要である。この双方向通信は高度にニューロンとグリア1,2の間の特定のシグナル伝達経路によって媒介される。これらのシグナル伝達経路の同定および特徴は、グリア相互作用の形中枢神経生理学にどのニューロンの理解に不可欠である。以前は、ニューロンとグリア細胞混合培養が広くニューロンとグリア細胞間のシグナル伝達経路をテストおよび特性評価に利用されてきた。我々 は 、in vivo のツールで 、これらの製剤と他から学んだことは、しかし、ニューロンとグリア細胞間の相互シグナリングがしばしばニューロン（ すなわち 、軸索、樹状突起、またはソーマ）3内の特定の区画で発生したことを示唆している。これは、重要な神経区画の分離を可能にする新しい培養システムを開発することができ、具体的にはグリア細胞と神経の間の相互作用を調べNAL軸索/樹状突起。加えて、従来の混合培養系は、可溶性因子とニューロンとグリア細胞間の直接メンブレン接点信号を区別することができるではありません。さらに、従来の共培養系におけるニューロンとグリア細胞の大量は、単一の軸索とグリア細胞間の相互作用を観察するために必要な決議を欠いている。
そこで本研究では、マイクロ流体文化プラットフォーム（MCP）を用いた新規軸索とグリア共培養系を記述します。この共培養系では、神経細胞とグリア細胞は、複数の中央のチャネルで接続されている2つの別々の室で培養される。このマイクロ流体文化のプラットフォームでは、唯一の神経プロセス（特に軸索）は、中央のチャネルを介してグリア側を入力することができます。強力な蛍光タンパク質の標識との組み合わせでは、このシステムはそのような、軸索/樹状細胞およびグリア相互作用の間のシグナル伝達経路を直接検査することができます神経端末におけるグリア、グリア媒介受容体の輸送、およびグリア媒介軸索成長のs軸索を介した転写調節。チャンバーの狭い直径も大きく軸索/樹状突起とグリアの表面との間の直接の膜タンパク質相互作用のプロービングを容易にして、グリアチャンバー内にニューロンに富んだ媒体の流れを禁止しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
MCPベースのニューロンとアストロサイトの共培養系は、軸索のみが中央のチャンネルを通過できるようにし、星状膠細胞と相互作用することにより、星状膠細胞シグナル伝達経路の詳細な神経細胞の解剖を可能にします。この共培養系は、便利な、従来のニューロンとアストロサイトの培養の手順で設定することができます。我々はまた、アストロサイトにおける軸索依存GLT1プロモーター?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、BAC GLT1たeGFPマウスとGLT1抗体を提供するための博士ジェフリー·ロススタインに感謝したいと思います。貴重なコア機能を提供するため、脳科学研究のためのタフツセンター（PI、ロブ·ジャクソンNIH P30 NS047243）;新教員採用助成金（NIH P30 5P30NS069254-02 ;タフツ神経科学部門のPI、フィル·ヘイドン）。
Materials
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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Neuron culture medium for plating cell
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Astrocyte culture medium
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Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
Referências
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
