Imaging Analyse av Neuron til gliaceller samhandling i Microfluidic Kultur Platform (MCP)-baserte Neuronal Axon og gliaceller Co-kultur System

Summary

Denne studien beskriver prosedyrene for å sette opp en ny neuronal axon og (astro) gliaceller co-kultur plattform. I dette samarbeidet kultur systemet, blir manipulering av direkte interaksjon mellom en enkelt axon (og eneste glial celle) gjennomførbart, slik mekanistisk analyse av gjensidig nervecelle til glial signalering.

Abstract

Riktig nervecelle til gliaceller interaksjon er kritisk til fysiologisk funksjon av sentralnervesystemet (CNS). Dette toveiskommunikasjon er sophisticatedly mediert av spesifikke signalveier mellom nevroner og gliaceller ^1,2. Identifisering og karakterisering av disse signalveier er viktig for forståelsen av hvordan nervecelle til gliaceller interaksjon former CNS fysiologi. Tidligere har Nevron og gliaceller blandede kulturer blitt mye benyttet til testing og karakterisere signalveier mellom nevroner og gliaceller. Det vi har lært av disse preparatene og andre in vivo verktøy, har imidlertid antydet at gjensidige signalering mellom nevroner og gliaceller ofte skjedd i bestemte avdelinger innenfor nevroner (dvs. axon, dendrite eller soma) ^3. Dette gjør det viktig å utvikle en ny kultur system som tillater separasjon av neuronal kamrene og spesielt undersøker samspillet mellom gliaceller og nevronale axons / dendritter. I tillegg er den konvensjonelle blandede kultur systemet ikke i stand til å differensiere de oppløselige faktorer og direkte membran kontakt signaler mellom nevroner og gliaceller. Videre mangler den store mengden av nevroner og gliaceller i konvensjonelle co-kultursystem oppløsningen nødvendig å observere samspillet mellom en enkelt axon og en glial celle.

I denne studien, beskriver vi en roman axon og gliaceller co-kultur-system med bruk av en microfluidic kultur plattform (MCP). I denne co-kultursystem, blir neuroner og gliaceller dyrket i to separate kamre som er forbundet via flere sentrale kanaler. I denne microfluidic kultur plattform, kan bare neuronal prosesser (spesielt axoner) inn i glial side gjennom de sentrale kanalene. I kombinasjon med kraftig fluorescerende protein merking, gjør dette systemet direkte undersøkelse av signalveier mellom aksonal / dendrittiske og glial interaksjoner, for eksempel ens axon-mediert transcriptional regulering i gliaceller, gliaceller-mediert reseptor menneskehandel neuronal terminaler, og gliaceller-mediert axon vekst. Den smale diameter av kammeret også forbyr signifikant flyten av neuron-anrikede medium til glial kammeret, tilrettelegging sondering av direkte membran-protein interaksjon mellom axoner / dendritter og glial overflater.

Protocol

1. Montering av Microfluidic Kultur Chamber (MCP) MCP (Figur 1) er åpne kamre utformet for compartmented kulturer av forskjellige typer celler 4. Den har typisk to avdelinger som er forbundet via de sentrale kanaler (3 mikrometer i diameter). Montering av MCP med glass-bunn retter er nødvendig for å forberede kulturer og påfølgende bildebehandling analyse. Først, frakk sterile glass-bunn retter med Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) oppløst i natrium tetrabor…

Representative Results

Time-lapse avbildning analyse av axon-indusert GLT1 promoter aktivering i astrocytes Den compartmented nevron og astrocyte co-kultur systemet tillater bare neuronal prosesser, spesielt aksoner, til selektivt samhandle med astrocytes. Etter den vellykkede etableringen av axon og astrocyte (eller andre gliacellene) co-kultur i det sammensatte MCP, kan ulike typer axon-gliaceller interaksjoner bli studert som; axon-indusert aktivering av astroglial genpromotoren aktivisering, astrocyte-indusert ax…

Discussion

MCP baserte neuron og astrocytes co-kultur systemet tillater disseksjon av detaljert nervecelle til astroglia signalveier ved at bare axons passere de sentrale kanalene og samspill med astroglial celler. Dette samarbeidet kultur systemet kan enkelt settes opp med konvensjonell nevron og astrocyte kultur prosedyrer. Vi har også beskrevet en praktisk anvendelse av dette samarbeidet kultur systemet ved å bruke en eGFP basert reporter for å demonstrere axon-avhengige GLT1 promoter aktivering i astrocytes.

<p class="j…

Materials

Fetal bovine serum	Hyclone	SH30070.03	for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135	for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor	R&D systems	212-GD	Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose	Sigma-Aldrich	11995
70 mm cell strainer	BD Falcon	352350
Sterile glass bottom dish	MatTek Corporation
Microfluidic culture platforms	Xona Microfluidics LLC	SND150
6 wells of the culture plate	Cellstar	657 160
			Neuron culture medium Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin
			Neuron culture medium for plating cell Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin 5% Fetal bovine serum SH30070.03
			Astrocyte culture medium Dulbecco modified eagle medium high glucose 10% Fetal bovine serum F4135 1% Penicillin-streptomysin
			Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.