Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura
Summary
Este estudo descreve os procedimentos de criação de um axônio neuronal e romance (astro) glia plataforma de co-cultura. Neste sistema de co-cultura, a manipulação da interacção directa entre um único axónio (e única célula glial) torna-se possível, permitindo a análise mecanicista do neurónio mútuo de sinalização gliais.
Abstract
Neurónio adequado para interacção glia é crítica para a função fisiológica do sistema nervoso central (SNC). Esta comunicação bidirecional é sofisticada específicas mediadas por vias de sinalização entre neurônios e células gliais 1,2. Identificação e caracterização de tais vias de sinalização é essencial para a compreensão de como a fisiologia neurônio glia interacção CNS formas. Anteriormente, neurônios e células gliais culturas mistas têm sido amplamente utilizados para testes e caracterização de vias de sinalização entre neurônios e células gliais. O que aprendemos com essas preparações e outras ferramentas in vivo, no entanto, sugeriu que a sinalização mútuas entre neurônio e glia que ocorreram geralmente em compartimentos específicos dentro dos neurônios (axônio, dendrito, ou soma) 3. Isto torna importante o desenvolvimento de um sistema de cultura novo, que permite a separação dos compartimentos neuronais e, especificamente, examina a interacção entre as células gliais e neuroaxônios NAL / dendritos. Além disso, o sistema de cultura convencional mista não é capaz de diferenciar os factores solúveis e os sinais de membrana por contacto directo entre neurónios e células gliais. Além disso, a grande quantidade de neurónios e células gliais no sistema de co-cultura convencional não tem a resolução necessária para observar a interacção entre um único axónio e uma célula glial.
Neste estudo, descrevemos uma nova axónio e glia do sistema de co-cultura com a utilização de uma plataforma de cultura de microfluidos (MCP). Neste sistema de co-cultura, os neurónios e células gliais são cultivadas em duas câmaras separadas, que estão ligados através de múltiplos canais centrais. Nesta plataforma de cultura de microfluidos, apenas processos neuronais (especialmente axónios) pode entrar no lado glial através dos canais centrais. Em combinação com a marcação de proteínas poderoso fluorescente, este sistema permite a análise directa das vias de sinalização entre as interações axonais / dendrítica e glial, tals regulação axônio mediada transcrição em glia tráfico receptor, mediada por células gliais em terminais neuronais, e glia mediada crescimento do axônio. O diâmetro estreito da câmara também significativamente proíbe o fluxo do meio para neurónios enriquecidos para a câmara de glial, facilitando sondagem da interacção proteína-membrana directa entre axónios / dendritos e superfícies gliais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O neurônio MCP baseado e astrócitos sistema de co-cultura de neurônio permite dissecção detalhada para as vias de sinalização astroglia permitindo que somente os axônios passam os canais centrais e interagindo com as células gliais. Este sistema de co-cultura pode ser convenientemente configurado com o neurônio convencional e procedimentos de cultura de astrócitos. Nós também descrita uma aplicação prática deste sistema de co-cultura utilizando um repórter baseado eGFP para demonstrar a activação depe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Jeffrey Rothstein para a prestação de ratos BAC GLT1 EGFP e GLT1 anticorpos; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243; PI, Rob Jackson) para a prestação de importantes instalações valiosos; Nova faculdade de recrutamento de subvenção (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) na Tufts Neuroscience Departamento.
Materials
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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Neuron culture medium for plating cell
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Astrocyte culture medium
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Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
Referências
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