Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura
Summary
Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.
Abstract
Neurona adecuada a la interacción glia es fundamental para la función fisiológica del sistema nervioso central (SNC). Esta comunicación bidireccional está sofisticadamente mediada por vías de señalización específicas entre neuronas y glía 1,2. Identificación y caracterización de estas vías de señalización es esencial para la comprensión de cómo neurona a la interacción glia formas CNS fisiología. Anteriormente, los cultivos de neuronas y células gliales mixtos han sido ampliamente utilizados para la prueba de las vías de señalización entre las neuronas y la glía. Lo que hemos aprendido de estos preparativos y otras herramientas in vivo, sin embargo, se ha sugerido que la señalización mutuas entre neuronas y glía ocurrieron a menudo en compartimentos específicos dentro de las neuronas (es decir, axón, dendrita, o soma) 3. Esto hace que sea importante para desarrollar un nuevo sistema de cultivo que permite la separación de los compartimentos neuronales y, específicamente, examina la interacción entre células gliales y neuroNAL / axones dendritas. Además, el sistema de cultivo mixto convencional no es capaz de diferenciar los factores solubles y directos señales de contacto entre la membrana neuronal y glial. Además, la gran cantidad de neuronas y células gliales en el co-cultivo convencional sistema carece de la resolución necesaria para observar la interacción entre un solo axón y una célula glial.
En este estudio, se describe un axón y un sistema nuevos glia co-cultivo con el uso de una plataforma de cultura microfluídico (MCP). En este sistema de co-cultivo, las neuronas y las células gliales se cultivó en dos cámaras separadas que están conectadas a través de múltiples canales centrales. En esta plataforma de microfluidos cultura, sólo los procesos neuronales (especialmente los axones) puede entrar en el lado glial a través de los canales centrales. En combinación con el etiquetado potente proteína fluorescente, este sistema permite el examen directo de las vías de señalización entre las interacciones axonal / dendrítico y glial, tals axón mediada por la regulación transcripcional en células gliales, el tráfico del receptor mediada por células gliales en terminales neuronales y gliales mediada por el crecimiento del axón. El diámetro estrecho de la cámara también significativamente prohíbe el flujo del medio de neurona enriquecido en la cámara de glial, facilitando el sondeo de la membrana directa-proteína interacción entre axones / dendritas y superficies gliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La neurona MCP y basado en sistema de astrocitos de co-cultivo permite la disección de neurona detallada a astroglía vías de señalización permitiendo que sólo los axones pasan los canales centrales y la interacción con las células astrogliales. Este sistema de co-cultivo se puede configurar cómodamente con neurona convencional y los procedimientos de astrocitos cultura. También se describe una aplicación práctica de este sistema de co-cultivo mediante el empleo de un reportero eGFP base para demostrar axón …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias al Dr. Jeffrey Rothstein para proporcionar GLT1 BAC ratones EGFP y anticuerpos GLT1; Tufts Center para Investigación de Neurociencia (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) para proporcionar servicios de valor básicos; Nueva facultad de contratación de subvención (NIH P30-02 5P30NS069254 , PI, Phil Haydon) en Tufts Neurociencias Departamento.
Materials
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
|
Neuron culture medium for plating cell
|
|||
|
Astrocyte culture medium
|
|||
|
Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
Referências
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
